干細(xì)胞移植對擴(kuò)張型心肌病模型兔心肌膠原及血管影響

徐潔　曹桂秋

[摘 要] 目的：分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Marrow mesenchymal stem cells，MSCs）移植對擴(kuò)張型心肌?。―ilated cardiomyopathy，DCM）模型兔心肌膠原及血管影響，探討該方案治療DCM的可行性。方法：選取60只新西蘭大白兔，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型對照組、模型移植組，各20只，正常對照組不接受特殊處理，模型對照組、模型移植組均建立兔DCM模型，模型移植組接受MSCs處理。評價三組心功能變化，并比較其移植治療4周后心肌膠原及心肌微血管密度（MVD）差異，總結(jié)MSCs移植的作用效果與機(jī)理。結(jié)果：移植治療4周后，正常對照組、模型移植組實(shí)驗(yàn)兔均存活，模型對照組實(shí)驗(yàn)兔存活率為70.00%，低于其他兩組；與造模前相比，模型對照組、模型移植組移植治療4周后LVEDD、LVESD均升高，LVEF均下降，模型對照組變化更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。移植治療4周后，模型移植組MVD高于正常對照組，模型對照組MVD低于正常對照組；模型對照組心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及其比值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），模型移植組上述指標(biāo)與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：MSCs移植能夠抑制DCM模型實(shí)驗(yàn)兔心功能惡化進(jìn)程，其作用機(jī)理與提高心肌膠原水平、促進(jìn)心肌微血管生成有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；擴(kuò)張型心肌病；心肌膠原；微血管密度

中圖分類號：R394 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）06-009-03

DOI：10.11876/mimt201606004

擴(kuò)張型心肌?。―ilated cardiomyopathy，DCM）預(yù)后差 [1]。藥物治療對于DCM患者臨床癥狀的控制具有一定作用，但僅可延緩嚴(yán)重心力衰竭發(fā)生時間，無法逆轉(zhuǎn)心室擴(kuò)張進(jìn)程 [2]。行心臟移植供體較為缺乏，加之排斥反應(yīng)、價格昂貴、術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險高等弊端，均限制了心臟移植的臨床應(yīng)用。近年來，大量學(xué)者開始關(guān)注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Marrow mesenchymal stem cells，MSCs）移植治療DCM的可行性，MSCs具有高度擴(kuò)增、多向分化潛能[3]，本研究分析實(shí)驗(yàn)兔模型，探討MSCs移植治療DCM機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

普通級新西蘭大白兔60只，雌雄不拘，月齡3個月，體質(zhì)量（2.26±0.37）kg，均由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對照組、模型對照組、模型移植組，各20只。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：鹽酸阿霉素粉針劑（深圳萬樂藥業(yè)股份有限公司）；羊抗兔Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體（上海瑞齊生物科技有限公司）；免疫組化EliVisionTMplus廣譜試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

主要儀器：iE-33多普勒彩色超聲診斷儀（荷蘭飛利浦公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模 60只實(shí)驗(yàn)兔均在相同條件下飼養(yǎng)，模型對照組、模型移植組均建立兔DCM模型，耳緣靜脈注射2 mg/kg鹽酸多柔比星（阿霉素），每周1次，持續(xù)8周[4]。每周記錄實(shí)驗(yàn)兔體質(zhì)量，觀察其毛色、運(yùn)動量、進(jìn)食量及腹水等狀態(tài)。模型移植組接受MSCs處理。

1.3.2 MSCs移植 造模8周后，抽取兔股骨骨髓4 mL，參照文獻(xiàn)方法實(shí)施MSCs分離純化、培養(yǎng)、鑒定[5-6]。

將MSCs用0.25%的胰蛋白酶消化、吹打形成單細(xì)胞懸液，低速離心收集細(xì)胞，將濃度為106的MSCs裝入微量注射器準(zhǔn)備移植。取模型移植組兔，于左心室游離壁分5點(diǎn)注入制備好的骨髓干細(xì)胞懸液，每點(diǎn)約30～50 μL，深度4 mm，共1.0×108 個細(xì)胞。注射位置以6/0絲線作標(biāo)記。注射器與心臟呈30℃進(jìn)針，注射前回抽，防止細(xì)胞注入心腔。注射過程中需密切注意實(shí)驗(yàn)兔心率、呼吸，防止心律失常和急性左心衰的發(fā)生，模型對照組按同樣方式于對應(yīng)時間點(diǎn)注入等量DMEM 培養(yǎng)液[7]。檢查無活動性出血后逐層關(guān)胸。胸穿抽出胸腔氣體，使左肺復(fù)張。

1.3.3 觀察指標(biāo) 記錄各組實(shí)驗(yàn)兔造模成功后（移植治療后）生存率，并分別于造模前、于移植治療4周后，對三組實(shí)驗(yàn)兔心功能進(jìn)行檢測，檢測指標(biāo)包括左室收縮末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVESD）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）；于模型移植組移植治療4周后同時處死各組實(shí)驗(yàn)兔，取其左心室心肌組織，參照文獻(xiàn)方法檢測其心肌微血管密度（MVD）及心?、?、Ⅲ型膠原平均光密度值[8-9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS20.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以（n/%）表示，并采用χ2檢驗(yàn)，計量資料以（x±s）表示，三組間比較采用F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存情況

移植治療4周后正常對照組、模型移植組實(shí)驗(yàn)兔均存活，模型對照組實(shí)驗(yàn)兔存活率為70.00%，低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 心功能變化

移植治療4周后模型對照組、模型移植組LVEDD、LVESD均較造模前升高，LVEF均下降，模型對照組變化更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 微血管密度及心肌膠原

正常對照組、模型對照組、模型移植組MVD分別為（26.27±4.39）、（14.36±4.42）、（39.05±5.87），模型移植組MVD高于正常對照組，模型對照組MVD低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

移植治療4周后模型對照組心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及其比值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），模型移植組上述指標(biāo)與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

DCM病理改變以心肌細(xì)胞數(shù)量減少與功能減退為主要病理改變，當(dāng)心肌細(xì)胞數(shù)量減少到一定程度所致殘存心肌細(xì)胞代償功能受損時，心臟泵血功能難以有效維持，即可導(dǎo)致心力衰竭等嚴(yán)重癥狀，威脅患者生存 [10]。近年來，干細(xì)胞移植治療心血管疾病文獻(xiàn)報道增多[11-12]。

本研究采取經(jīng)典耳緣靜脈注射阿霉素的方法建立兔DCM模型，就干細(xì)胞移植的治療效果及機(jī)制進(jìn)行探討。

可以發(fā)現(xiàn)，與造模前相比，移植治療4周后模型對照組、模型移植組LVEDD、LVESD均呈現(xiàn)上升趨勢且LVEF明顯下降，符合DCM的臨床表現(xiàn)[13]，而模型對照組心功能變化更為明顯，說明MSCs移植在延緩心功能惡化方面發(fā)揮了積極作用，與Zhang等[14]大鼠DCM模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

為進(jìn)一步明確MSCs移植治療DCM的機(jī)理，本研究對實(shí)驗(yàn)兔左室心肌膠原及血管狀態(tài)變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，移植治療4周后模型對照組心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及其比值明顯升高，而既往研究表明，心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原的升高可體現(xiàn)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過度活化，這一病理生理改變所致心肌細(xì)胞凋亡是造成左室重構(gòu)加劇、心力衰竭發(fā)生發(fā)展的主要原因[15]。

與此同時，模型移植組心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及其比值與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮與MSCs移植后，心肌膠原mRNA穩(wěn)定性增加、膠原纖維降解減少有關(guān)，這一機(jī)制能夠有效抑制心肌及間質(zhì)細(xì)胞增生，延緩心肌肥大與纖維化進(jìn)程，降低心肌重塑風(fēng)險[16]。

在MVD的觀察中可以發(fā)現(xiàn)，移植治療4周后DCM模型兔心肌MVD明顯下降，說明心肌細(xì)胞的大量丟失與功能受損可影響血管新生能力，加之纖維化、再生功能及各類生長因子生成障礙，共同造成DCM病程進(jìn)展[17]。而MSCs移植能夠補(bǔ)充丟失的心肌細(xì)胞，促進(jìn)生長因子分泌、改善血管內(nèi)皮功能，從而改善心肌內(nèi)微循環(huán)障礙狀態(tài)，達(dá)到恢復(fù)心功能的目的。Lin等[18]發(fā)現(xiàn)，MSCs還可與血管內(nèi)皮生長因子2受體發(fā)揮交聯(lián)作用，在發(fā)揮促血管生成作用的同時，還具有保護(hù)心肌、抗凋亡、促細(xì)胞分裂、抗纖維化等多種效應(yīng)，有望推廣于其他缺血性疾病的治療。

綜上所述，MSCs移植能夠降低DCM模型兔心肌膠原水平、上調(diào)MVD，對于局部心肌血流的恢復(fù)與心功能的改善具有積極意義，為DCM臨床治療策略的選擇提供了新的方向，值得進(jìn)一步探索。

參 考 文 獻(xiàn)

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