經(jīng)不同輸注途徑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效比較

張美華+余衛(wèi)+王巧瑜+溫凌+蕭間開+潘潔

【摘要】 目的 比較經(jīng)腹腔注射與經(jīng)尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效。方法 選取10只體重約80 g的雄性清潔級SD大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）培養(yǎng)。另選取體重220～250 g的成年大鼠60只作為研究對象， 用于肝衰竭模型制備以及BMSCs輸注治療。將其中15只大鼠作為空白對照組， 剩下的45只均給予白毒傘粗毒素灌胃制備肝衰竭模型， 將造模成功的大鼠隨機(jī)均分為3組， 即肝衰竭模型組、經(jīng)腹腔注射治療組及經(jīng)尾靜脈注射治療組。對兩治療組予BMSCs經(jīng)兩種途徑輸注治療， 對比各組大鼠7 d生存率及肝功能、凝血功能、炎癥因子等指標(biāo)情況。

結(jié)果 與肝衰竭模型組相比， 兩治療組SD大鼠體重減輕明顯更少（P<0.05）， 7 d生存率要明顯更高[73.3%、80.0% VS 20.0%]（P<0.05）， 兩治療組上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后兩治療組大鼠肝功能、凝血功能、炎癥因子等指標(biāo)均較肝衰竭模型組顯著改善（P<0.05）， 兩治療組上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， 空白對照組大鼠肝功能、凝血功能、炎癥因子等指標(biāo)與其他三組比較， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 經(jīng)腹腔注射和經(jīng)尾靜脈注射兩種輸注途徑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠具有十分明顯的治療作用， 能顯著改善大鼠肝功能衰竭， 且效果相當(dāng)。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；白毒傘；急性肝衰竭；療效；輸注途徑

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.192

白毒傘（amanita verna）為劇毒蘑菇， 近年來廣東地區(qū)頻頻發(fā)生因誤食白毒傘而中毒死亡的事件。白毒傘鵝膏毒肽主要損害肝臟， 其中毒致急性肝衰竭死亡率>95%， 危害極大。白毒傘中毒致急性肝衰竭（AALF）發(fā)病兇猛， 臨床癥狀復(fù)雜， 治療難度較大， 至今仍是醫(yī)學(xué)界的難題之一[1]。目前國內(nèi)外仍然缺乏對白毒傘中毒致急性肝衰竭的有效治療手段， 而隨著醫(yī)學(xué)界對干細(xì)胞研究的逐漸深入， 應(yīng)用干細(xì)胞對急性肝衰竭的治療已經(jīng)得到了迅速的發(fā)展。本研究以此為背景， 比較經(jīng)腹腔注射與經(jīng)尾靜脈注射兩種不同輸注途徑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效， 旨在為選擇合理的輸注途徑提供參考， 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取10只體重約80 g的雄性清潔級SD大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的培養(yǎng)。另選取體重220～250 g的SD大鼠60只作為研究對象， 用于模型制備以及BMSCs輸注治療。實(shí)驗(yàn)動物由廣州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供， 實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。將其中15只大鼠作為空白對照組， 另外45只均給予白毒傘粗毒素灌胃制備肝衰竭模型， 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為肝衰竭模型組、經(jīng)腹腔注射治療組及經(jīng)尾靜脈注射治療組， 各15只。

1. 2 儀器與試劑 主要試劑包括DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（四季清公司）、胰蛋白酶（寶泰克公司）、PBS緩沖液（自制）。主要儀器包括超凈工作臺、恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、離心機(jī)、水浴箱、低溫冰箱等。

1. 3 BMSCs的制備 將所選取用于制備 BMSCs的大鼠斷頸處死， 取其股骨， 無菌條件下采集大鼠骨髓液， 采用密度梯度離心法[2]， 反復(fù)貼壁分離純化BMSCs?？鼓撬铇?biāo)本置于Percoll分離液梯度離心， 吸取中間單個核細(xì)胞（MNC）白膜層， 以1×106/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶， 培養(yǎng)體系為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基， 置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后換液， 之后每隔3～4 d換液1次， 取出懸浮細(xì)胞后， BMSCs將不斷純化。當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)到80%～90%時， 用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化分散的細(xì)胞。此時將細(xì)胞標(biāo)記為P1代， 以后每隔3～4 d換液1次， 當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)到80%～90%的時候， 繼續(xù)以1∶3的密度傳代擴(kuò)增培養(yǎng)， 取第3代BMSCs細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液， 將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml備用。

1. 4 白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠模型制備及治療 參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 分別對45例實(shí)驗(yàn)大鼠給予白毒傘粗毒素0.5 mg/kg劑量灌胃1次， 48 h后即可制備穩(wěn)定的白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠動物模型。造模成功后通過腹腔注射和經(jīng)尾靜脈注射對兩治療組大鼠實(shí)施BMSCs的輸注治療， 共3次， 1次/d， 細(xì)胞數(shù)量1×106/（kg·次）。

1. 5 觀察指標(biāo) ①SD大鼠的生存情況、體重變化情況；②治療結(jié)束各組大鼠采尾靜脈血檢測肝功能及凝血功能；③治療結(jié)束采尾靜脈血測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL-6）等炎癥因子含量， 評價實(shí)驗(yàn)SD大鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)情況。

1. 6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肝衰竭模型組與兩治療組大鼠生存及體重情況比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與肝衰竭模型組比較， 治療結(jié)束后兩治療組大鼠體重減輕明顯更少（P<0.05）， 7 d生存率明顯更高（P<0.05）；經(jīng)腹腔注射治療組與經(jīng)尾靜脈注射治療組體重減輕及7 d生存率比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較 治療后采血行肝功能檢查， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與肝衰竭模型組比較， 兩治療組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）明顯降低（P<0.05）， 白蛋白（ALB）明顯升高（P<0.05）；兩治療組ALT、AST、TBIL、ALB比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?？瞻讓φ战MALT、AST、TBIL與其他三組比較明顯降低， ALB明顯升高， 比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 各組大鼠凝血功能指標(biāo)和炎癥因子數(shù)量比較 治療后采血檢測炎癥因子和凝血功能， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與肝衰竭模型組比較， 兩治療組大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）明顯降低（P<0.05）；兩治療組TNF-α、IL-6、PT、APTT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?？瞻讓φ战MTNF-α、IL-6、PT、APTT與其他三組比較明顯降低， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

白毒傘為劇毒蘑菇， 近年來廣東地區(qū)頻頻發(fā)生因誤食白毒傘而中毒死亡的事件。誤采、誤食野生蕈中毒事件中， 95%是由鵝膏蕈所致。鵝膏毒肽是鵝膏蕈所含的最重要致死毒素， 鵝膏毒肽能溶于水， 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 耐高溫和酸堿。食入后， 可迅速被消化道吸收進(jìn)入肝臟， 并能迅速與肝細(xì)胞RNA聚合酶結(jié)合， 抑制mRNA的生成， 造成肝細(xì)胞壞死， 導(dǎo)致急性肝功能衰竭[3]， 嚴(yán)重危害人類的健康。而急性肝衰竭能否逆轉(zhuǎn)主要取決于患者受損肝細(xì)胞的壞死程度以及殘留肝細(xì)胞的再生能力， 因此阻斷肝細(xì)胞壞死， 促進(jìn)肝細(xì)胞再生是決定治療是否成功的必要條件。

近年來， 隨著干細(xì)胞研究的不斷深入， 干細(xì)胞移植在肝臟疾病的治療中也更受重視。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種， 是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞。BMSCs不但能夠與其他細(xì)胞一起支持造血干細(xì)胞的造血， 還能夠在不同的誘導(dǎo)條件下分化成多種組織細(xì)胞， 這也使得BMSCs成為組織工程、細(xì)胞以及基因治療最為理想的靶細(xì)胞[4]。BMSCs具有十分強(qiáng)的定向分化能力， 具有自體移植不排斥的優(yōu)點(diǎn)， 在異基因移植中也能夠長期存活并保持其正常的生物學(xué)功能。此外， BMSCs的來源非常廣泛， 其具有采集、制備程序簡單、分化能力強(qiáng)、性能穩(wěn)定、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。研究表明BMSCs具有向肝細(xì)胞分化的能力， 體外細(xì)胞因子誘導(dǎo)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證明BMSCs可以分化成肝細(xì)胞或肝樣細(xì)胞[5， 6]。另有實(shí)驗(yàn)證明BMSCs在肝臟病理?xiàng)l件下能夠分化為具有部分生理功能的類肝樣細(xì)胞， 向具有正常功能的肝細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 并參與修復(fù)損傷的肝臟， 發(fā)揮合成、解毒、代謝等功能， 對肝衰竭有顯著的治療作用， 降低肝衰竭的死亡率[7， 8]。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步開展BMSCs輸注治療終末期肝病創(chuàng)造了條件， 為白毒傘中毒致急性肝衰竭患者的治療帶來了新希望。有研究表明， 經(jīng)腹腔注射BMSCs較經(jīng)尾靜脈注射成功率更高[9]。但經(jīng)尾靜脈注射可直接進(jìn)入血液， 藥物吸收快。因此， 兩種輸注途徑注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效有待通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。

本實(shí)驗(yàn)利用白毒傘粗毒素灌胃制備大鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭模型， 分別通過腹腔注射和尾靜脈注射途徑予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注治療。研究結(jié)果顯示， 進(jìn)行經(jīng)腹腔和尾靜脈注射BMSCs移植治療均能夠顯著提高AALF大鼠的一般生存情況和生存率， 顯著改善AALF大鼠肝功能、凝血功能以及炎癥反應(yīng)情況， 且效果相當(dāng)， 提示采用兩種途徑輸注BMSCs治療對白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠均具有十分顯著的療效。這直接說明了所移植的BMSCs能夠在急性肝衰竭的大鼠肝臟中轉(zhuǎn)化為具有正常生物學(xué)功能的肝細(xì)胞。因此， 采用腹腔和尾靜脈注射移植BMSCs治療急性肝衰竭都是可行有效的[10， 11]。

綜上所述， 采用經(jīng)腹腔和尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療對白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠均具有十分顯著的療效， 能顯著改善大鼠肝功能衰竭情況， 提高生存率。如果經(jīng)上述兩種途徑輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療運(yùn)用于臨床白毒傘中毒患者， 將為廣大因誤食白毒傘而中毒致急性肝衰竭的患者帶來巨大的福音。

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[收稿日期：2016-03-25]