骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)犬面神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究

李陽等

摘要：目的 探討實(shí)驗(yàn)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)犬面神經(jīng)缺損的效果，以更好的應(yīng)用于臨床研究。方法 選用8只成年當(dāng)?shù)厝?，抽取骨髓液得到單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)、純化后獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。犬的兩側(cè)面神經(jīng)頰支分別造成平均25mm的缺損，一側(cè)硅膠管套管連接后植入MSCs修復(fù)，另一側(cè)單純硅膠管套管修復(fù)。于術(shù)后第4、8、12、16w行大體觀察，作組織學(xué)檢查，，以評價(jià)神經(jīng)再生恢復(fù)情況。結(jié)果 第4w時(shí)雙側(cè)管內(nèi)未見明顯再生神經(jīng)纖維；第12，16w時(shí)，再生神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)，MSCs側(cè)，均高于單純套管側(cè)，且差異顯著（P<0.05）。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)面神經(jīng)缺損的修復(fù)，MSCs可應(yīng)用于外周神經(jīng)缺損的修復(fù)。

關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；面神經(jīng)缺損；神經(jīng)再生

腫瘤術(shù)后或外傷等原因造成面神經(jīng)缺損是口腔頜面外科臨床經(jīng)常遇到的問題。面神經(jīng)缺損喪失嚴(yán)重影響面部功能與外形，不能完成正常的咀嚼、吞咽、語言活動，且面部外形異常，流涎；口角歪斜，眼瞼閉合不全，額紋消失等。面神經(jīng)修復(fù)的目的不僅是恢復(fù)面神經(jīng)的連續(xù)性，維持患者正常的容貌形態(tài)，而且是為了恢復(fù)患者的咀嚼語言等功能。目前臨床上采用各種修復(fù)方法，例如神經(jīng)移植（耳大神經(jīng)，腓腸神經(jīng)等），套管法修復(fù)，但適應(yīng)癥常受到限制。

本實(shí)驗(yàn)主要采用體外分離、培養(yǎng)的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入面神經(jīng)缺損的硅膠套管內(nèi)，使其能轉(zhuǎn)化為雪旺細(xì)胞，促進(jìn)面神經(jīng)的修復(fù)，為修復(fù)神經(jīng)損傷提供新的方法。

1資料與方法

1.1犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)[1～4] 成年（1歲以上）的當(dāng)?shù)厝?只，雌雄不限，骨髓穿刺針接5ml注射器，注射器內(nèi)含稀釋的肝素鈉3 000 U 0.2 ml。從髂后上棘穿刺，抽取骨髓液4 ml，經(jīng)PBS液1：3稀釋后，以1：1緩慢注入預(yù)先加入密度為1.073 g/ml Percoll液的試管內(nèi)，密度梯度離心，2 000 rpm，30 min，吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS液洗2次，以2×105/ml的濃度接種于50 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，加5 ml L-DMEM液（含青霉素鈉100 U/ml，鏈霉素100Lg/ml），加入胎牛血清終濃度為10%。在5%CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)4 d。更換培養(yǎng)液，將未貼壁的細(xì)胞棄除，以后每3 d換液一次。12～14 d后基本長滿單層，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，再用細(xì)胞刮子刮落貼壁細(xì)胞，即得到原代培養(yǎng)的MSCs懸液。再以8×104/mL的細(xì)胞濃度傳代培養(yǎng)。取第3代MSCs植入缺損區(qū)的硅膠管內(nèi)。

1.2面神經(jīng)缺損模型制備 將成年犬用戊巴比妥鈉麻醉，沿雙側(cè)下頜骨下緣上口角旁處切開，暴露并游離面神經(jīng)頰支，因犬的面神經(jīng)頰支在體表位置恒定，在無張力狀態(tài)下居中切除平均25mm神經(jīng)，在顯微鏡下用11-0無損傷縫合線與直徑2 mm的硅膠管連接，對側(cè)作為對照組?？p合時(shí)應(yīng)避神經(jīng)張力過大或扭曲，分層縫合手術(shù)切口。術(shù)后肌注青霉素80萬U/d，連續(xù)3 d。

1.3 MSCs的植入 取體外培養(yǎng)的第3代骨髓MSCs，用含10%FBS的L-DMED制成細(xì)胞懸液，雙側(cè)面神經(jīng)缺損模型形成自身對照，隨機(jī)分為術(shù)后第4、8、12、16w 4組，每組2只。一側(cè)單純硅膠管連接面神經(jīng)缺損；另一側(cè)硅膠管套管內(nèi)，注入MSCs懸液至充滿套管。

2結(jié)果

手術(shù)后全部實(shí)驗(yàn)犬存活分別在4.8.12.16w取標(biāo)本，大體觀察4w時(shí)雙側(cè)管內(nèi)未見明顯再生神經(jīng)纖維；8周時(shí)雙側(cè)硅膠管內(nèi)見神經(jīng)兩端相互連接，中間區(qū)域神經(jīng)較細(xì)；12w時(shí)雙側(cè)管內(nèi)再生神經(jīng)纖維增粗直徑約神經(jīng)干直徑1/2，中間區(qū)域神經(jīng)明顯增粗；16w時(shí)雙側(cè)管內(nèi)再生神經(jīng)纖維增粗，直徑約近端神經(jīng)干直徑1/2～2/3。HE染色結(jié)果示第12，16w時(shí)，再生神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)，MSCs側(cè)，均高于單純套管側(cè)，且差異顯著（P<0.05）。

3討論

對周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)的研究目前臨床上多數(shù)為組織工程中的神經(jīng)構(gòu)建，大量基礎(chǔ)研究集中在神經(jīng)組織工程方面，它主要是根據(jù)周圍神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過分析神經(jīng)再生微環(huán)境中各種細(xì)胞與生長因子之間的相互作用關(guān)系，重點(diǎn)研究雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)和植入。

雪旺細(xì)胞在神經(jīng)再生中起重要作用，在外周神經(jīng)損傷后，雪旺細(xì)胞分裂、增殖引導(dǎo)軸突生長，并能分泌10余種雪旺細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，起到避免外周神經(jīng)損傷后引起的神經(jīng)元逆行性死亡，引導(dǎo)和促進(jìn)軸突再生以及促進(jìn)髓鞘形成的作用[5～8]。

MSCs（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）具有向多種細(xì)胞系分化的潛能，自體獲取回輸后不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng).易于體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增.在體外可長時(shí)間保持未分化狀態(tài)，體外基因轉(zhuǎn)染率高.并能穩(wěn)定高效表達(dá)多種治療性外源目的基因，加上骨髓來源豐富，采集方便安全、損傷小，因此MSCs不僅是組織工程的重要種子細(xì)胞，還是研究細(xì)胞增殖分化的理想細(xì)胞模型，與其多向分化的潛能相結(jié)合，必將為組織器官缺陷性疾病、退行性疾病、遺傳性疾病等治療開辟廣闊前景。

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編輯/許言