脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體MSCs修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗研究

劉長鐵　劉兵兵　晏小榮

摘要：目的 探討脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法。方法 ①選擇新西蘭大耳白兔24 只，雙下肢髁關(guān)節(jié)面上共制作3個直徑 3 mm、深3 mm 的全層軟骨缺損， 自左到右為：空白對照組（A組）， 脫鈣骨基質(zhì)（B組），脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細胞（C組）；②分別于術(shù)后 4，8，12 w各處死8只，應(yīng)用大體觀察、組織學(xué)觀察及組織學(xué)評分評估缺損軟骨的修復(fù)情況。結(jié)果 脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細胞組術(shù)后 12 w、組織切片顯示新生組織中可見大量類透明軟骨細胞出現(xiàn)，修復(fù)組織和周圍軟骨整合良好。C組各個時間點組織學(xué)評分均高于其他兩組（P<0.05）。結(jié)論 脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細胞提高了對兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果。

關(guān)鍵詞：脫鈣骨基質(zhì)；關(guān)節(jié)軟骨；自體；骨髓間充質(zhì)干細胞

組織工程學(xué)的發(fā)展給關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)帶來了生物學(xué)治療的美好前景。本實驗在前期成功將自體間充質(zhì)干細胞體外分離的基礎(chǔ)上，將之與可降解生物材料脫鈣骨基質(zhì)在體外短暫復(fù)合， 然后移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，以探討一種實用的關(guān)節(jié)軟骨缺損組織工程修復(fù)方法。

1 資料與方法

1.1脫鈣骨基質(zhì)材料的制備 將新西蘭大耳白兔處死后，取其骼骨，剔除骨膜、軟骨及軟組織，反復(fù)沖洗清除骨髓、血污及表面油脂，制備成4.0mm×4.0mm×3.0mm的條塊狀。

1.2方法 同一兔中雙下肢髁關(guān)節(jié)面上共制作3個直徑3mm、深3 mm的全層軟骨缺損，自左到右為：自左到右為：空白對照組（A組），脫鈣骨基質(zhì)（B組），脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細胞（C組）。查隨機數(shù)字表將24只大白兔隨機分為4、8 w和12 w三組。

1.3動物模型制做 做動物模型主要分為以下幾點：①術(shù)區(qū)備皮，手術(shù)者將兔取仰臥位，進行雙下肢備皮，常規(guī)消毒鋪巾。用3 mm的鉆頭在右股骨內(nèi)外髁左股骨內(nèi)髁造出直徑0.3cm、深度為0.3 cm全層厚軟骨缺損模型；②材料植入，徹底止血，用生理鹽水沖洗創(chuàng)口；③動物在相同條件下飼養(yǎng)。

1.4觀察指標(biāo) ①動物術(shù)后的具體情況；②關(guān)節(jié)面的修復(fù)情況；③缺損區(qū)新生組織組織學(xué)觀察及組織學(xué)評分（Wakitani評分）。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 組織學(xué)評分數(shù)據(jù)均記作（x±s），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差單向方差分析用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理， 比較各組評分與正常值均數(shù)間的差異，α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1大體觀察 C組：術(shù)后12 w修復(fù)區(qū)表面平整光滑，與周圍正常軟骨難以區(qū)分，色澤為瓷白色。B組：術(shù)后12 w外觀略有凹陷，色澤與周圍組織接近但仍可區(qū)分。A組：術(shù)后12 w缺損仍明顯，可見肉芽組織部分充填缺損。

2.2組織學(xué)觀察 C組：12 w后細胞體積較大數(shù)量較多，可見柱狀排列，與周圍正常軟骨組織相近，修復(fù)組織和周圍軟骨整合良好，TB染色為陽性。B組：12 w后HE染色可見短小卷曲的膠原纖維和軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，細胞排列不規(guī)則，TB染色為弱陽性。C組：12 w后缺損仍存在，缺損底部可見纖維組織充填部分缺損，TB染色為陰性。

2.3組織學(xué)評分 見表1。

表1結(jié)果表明， A組4、8、12 w評分值與C組相應(yīng)時刻評分值比較差異顯著（P<0.01）；A組4、8、12 w評分值與B組相應(yīng)時刻評分值比較差異顯著（P<0.01）；B組4、12w評分值與C組相應(yīng)時刻評分值比較差異顯著（P<0.01）。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種嚴(yán)重危害中老年人健康的退行性疾病，隨著老齡社會的到來，OA的發(fā)病率以驚人的速度逐年增長，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計，在50歲以上的人口中，其發(fā)病率僅次于心臟病而居第2位，給越來越多的患者帶來了肉體乃至精神上的痛苦和經(jīng)濟上的負擔(dān)，其病理特點為關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞、軟骨下硬化，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生、骨贅形成。所以，關(guān)節(jié)軟骨治療是OA治療的關(guān)鍵，關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管分布，當(dāng)缺損直徑超過3 mm時，不但自身再生修復(fù)能力有限，還可繼發(fā)周圍軟骨的退變，最終出現(xiàn)嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)功能明顯受限。目前臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法很多，但沒有公認最優(yōu)的能實現(xiàn)長期透明軟骨修復(fù)的方法，組織工程技術(shù)是再生修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損最具有潛力的方法之一。骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是骨髓中來源于中胚層、具有很強的增殖能力和多向分化特性的未分化的干細胞[1]。在不同誘導(dǎo)環(huán)境下，它可分化成為骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等， 并且這些細胞之間具有相互轉(zhuǎn)化的能力[2]，vanosch、zhou、Cao等[5]發(fā)現(xiàn)鈣骨基質(zhì)具有成軟骨能力，可以誘導(dǎo)干細胞向軟骨細胞分化。

本實驗在前期實驗基礎(chǔ)上，將骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離與脫鈣骨基質(zhì)短暫復(fù)合后移植入缺損關(guān)節(jié)處提高其修復(fù)效果，獲得了較為理想的實驗結(jié)果。初步觀察結(jié)果顯示，術(shù)后第4 w，脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體間充質(zhì)干細胞復(fù)合物植入缺損，修復(fù)面較平整；到第8 w時修復(fù)組織與周圍組織融合良好，修復(fù)表面平整；術(shù)后第12 w修復(fù)面平整光潔。

本實驗探討了用利用密度梯度離心原理對骨髓血進行快速細胞分離提取MSCS作為種子細胞復(fù)合脫鈣骨基質(zhì)支架材料移植用于修復(fù)實驗性關(guān)節(jié)軟骨缺損的實驗方法，在國內(nèi)外報道不多，并取得了較好的實驗效果，為臨床關(guān)節(jié)軟骨損傷的生物學(xué)治療提供了一個新的思路。

參考文獻：

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