番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆及其敲除載體的構(gòu)建

黃萍 劉洪 王慧 周倩

摘要：【目的】克隆番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici）SlCmr1基因，并構(gòu)建SlCmr1基因敲除載體，為研究該基因功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的番茄匍柄霉基因組信息設(shè)計引物，PCR擴增得到SlCmr1基因的DNA全長和CDS序列，并對SlCmr1基因編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用SlCmr1基因上、下游1100 bp左右的序列設(shè)計引物，分別PCR擴增SlCmr1基因的上、下游片段，通過酶切連接的方法將SlCmr1基因的上、下游序列分別插入載體pCX62，構(gòu)建SlCmr1基因敲除載體。【結(jié)果】SlCmr1基因的DNA全長為3275 bp，CDS長度為3018 bp，有3個內(nèi)含子，編碼蛋白序列全長1005 aa，分子式為C4882H7642N1404O1499S61，分子量為111.94 kD，理論等電點為（pI）6.64，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)58.72，親/疏水性平均值為-0.424，預(yù)測亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，存在2個相鄰的ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域和1個GAL4結(jié)構(gòu)域，推測SlCMR1為不含跨膜區(qū)域的非分泌、不穩(wěn)定可溶性蛋白。分別將SlCmr1基因上、下游序列插入pCX62載體，成功構(gòu)建了基因敲除載體pCX62-SlCmr1。【結(jié)論】SlCmr1可能是真菌調(diào)控色素合成的關(guān)鍵基因，在真菌的次級代謝產(chǎn)物合成中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 番茄匍柄霉;SlCmr1基因;基因克隆;生物信息學(xué)分析;基因敲除載體構(gòu)建

中圖分類號： S432.44? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-0976-08

Cloning and knockout vector construction of SlCmr1 gene in Stemphylium lycopersici

HUANG Ping， LIU Hong， WANG Hui， ZHOU Qian*

（College of Plant Protection，Hunan Agricultural University/Hunan Provincial Key Laboratory for Biology

and Control of Plant Diseases and Insects Pests， Changsha? 410128， China）

Abstract：【Objective】In order to study the function of SlCmr1 gene in Stemphylium lycopersici， cloning? of SlCmr1 gene was carried out， and gene knockout vector was constructed. 【Method】The primers of SlCmr1 gene were designed according to the S.lycopersici genome sequence provided by NCBI database. The full length DNA and CDS sequence of SlCmr1 gene were obtained by PCR amplification and the protein coded by SlCmr1 gene was analyzed through bioin formatics methods. Sequences around 1100 bp upstream and downstream of SlCmr1 gene were used to design primers. The upstream and downstream sequences of SlCmr1 were amplified by PCR and inserted into pCX62 vector by restriction enzyme digestion and SlCmr1 gene knockout vector was constructed. 【Result】SlCmr1 gene was 3275 bp in DNA sequence and 3018 bp in CDS sequence， including 3 introns， encoded 1005 amino acid protein sequence with molecular formula C4882H7642N1404O1499S61 and molecular weight 111.94 kD， predicted isoelectric point（pI） 6.64， half-life 30 h， instability index 58.72， mean value of hydrophilicity/hydrophobicity -0.424 and subcellular localization in nucleus. It was speculated that SlCMR1 was a non-secretory， unstable soluble protein without transmembrane region， and there were 2 adjacent ZnF_C2H2 domains and 1 GAL4 domain. SlCmr1 gene knockout vector pCX62-SlCmr1 was successfully constructed by inserting the upstream and downstream fragments of SlCmr1 gene into pCX62 vector. 【Conclusion】Slcmr1 may be a key gene regulating pigment synthesis and play an important role in the secondary metabolite synthesis in fungi.

Key words： Stemphylium lycopersici; SlCmr1 gene; gene cloning; bioinformatics analysis; construction of gene knockout vector

Foundation item： Hunan Natural Science Foundation（2018JJ3220）; Scientific Research Project of Hunan Education Department（19K040）

0 引言

【研究意義】匍柄霉屬（Stemphylium Wallroth）是無性真菌暗色絲孢科的重要類群，其中許多成員是植物上常見的弱寄生致病菌，可產(chǎn)生毒素殺死寄主細(xì)胞后從死亡的組織中獲取營養(yǎng)。番茄匍柄霉（S. lycopersici）是其中致病力較強、危害較大、寄主范圍較廣的成員之一，常為害番茄、萵苣、辣椒和甘藍(lán)等蔬菜，引起葉斑病。在我國由番茄匍柄霉引起的發(fā)生面積和危害程度最大的病害是番茄匍柄霉葉斑病，又稱番茄灰葉斑病，該病在環(huán)境濕度大、氣溫不穩(wěn)定的陰天發(fā)生快速，擴散能力強，現(xiàn)已在我國許多地方大面積暴發(fā)，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟損失（李寶聚等，2010）。Cmr1基因普遍存在于真菌中，編碼包含2個相鄰的ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域和1個Zn（II）2Cys6結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子（Tsuji et al.，2000）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，引起萵苣葉斑病的番茄匍柄霉菌株致病力強弱與其橙色色素的產(chǎn)量呈正相關(guān)，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示產(chǎn)色素少的菌株中Cmr1的同源基因表達(dá)量下調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)與前人研究結(jié)果矛盾（Eliahu et al.，2007;Cho et al.，2012）。因此，開展對番茄匍柄霉SlCmr1基因克隆、生物信息學(xué)分析及基因敲除載體構(gòu)建的研究，可為后續(xù)進(jìn)一步探討該基因編碼的蛋白在真菌色素合成調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)Cmr1及其同源基因的研究最早在黃瓜炭疽菌（Colletotrichum lagenarium）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中報道，發(fā)現(xiàn)它們編碼的蛋白是與真菌菌絲中黑色素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（Tsuji et al.，2000）。水稻胡麻病菌（Bipolaris oryzae）中Cmr1的同源基因Bmr1過表達(dá)導(dǎo)致黑色素的合成增加（Kihara et al.，2008）。鏈格孢（A.alternata）中Cmr1的同源基因CmrA沉默后黑色素合成抑制，導(dǎo)致菌落呈白色（Fetzner et al.，2014）。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中VdCmr1基因也是調(diào)控黑色素合成的關(guān)鍵因子（Wang et al.，2018）。灰霉（Botrytis cinerea）和盾殼霉（Coniothyrium minitans）中Cmr1的同源基因均與黑色素合成相關(guān)（Schumacher，2016;Luo et al.，2018）。Eliahu等（2007）在研究玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）時發(fā)現(xiàn)Cmr1基因缺失的突變體菌落不產(chǎn)生黑色素，但會產(chǎn)生橙粉色素。隨后在蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola）中報道，Cmr1同源基因Amr1缺失也在導(dǎo)致菌落黑色素合成抑制的同時橙色色素合成增加，并且Amr1缺失突變體對寄主的致病力顯著增強（Cho et al.，2012）。目前，關(guān)于Cmr1及其同源基因功能的報道均是正調(diào)控黑色素的形成，在玉米小斑病菌（Eliahu et al.，2007）和蕓薹生鏈格孢（Cho et al.，2012）的研究中還發(fā)現(xiàn)它們同時負(fù)調(diào)控橙色色素的合成，且蕓薹生鏈格孢的Amr1基因還控制病菌的致病力?！颈狙芯壳腥朦c】番茄匍柄霉在我國引起多種蔬菜葉斑病，嚴(yán)重影響我國蔬菜的質(zhì)量和產(chǎn)量，但目前有關(guān)番茄匍柄霉色素合成及致病力相關(guān)基因的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從橙色色素產(chǎn)量高、致病力強的番茄匍柄霉菌株CS12中克隆SlCmr1基因及其CDS序列，對其編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建SlCmr1基因敲除載體，為下一步在番茄匍柄霉中敲除該基因，明確番茄匍柄霉中該基因的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試番茄匍柄霉菌株CS12由植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室分離培養(yǎng)并保存。pCX62載體為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張正光教授惠贈?？俁NA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Pfu酶、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程（上海）股份有限公司;限制性內(nèi)切酶Hind III、Kpn I、BamH I和Xba I購自TaKaRa公司，T4連接酶購自Promega公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 番茄匍柄霉DNA、總RNA提取及cDNA合成 將液體培養(yǎng)的菌株CS12用CTAB法（李煥宇等，2017）提取DNA，根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取菌株CS12的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得菌株CS12的cDNA。DNA和總RNA分別用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

1. 2. 2 SlCmr1基因全長及CDS序列克隆 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)和NCBI中番茄匍柄霉SlCmr1基因序列，用Primer 5.0設(shè)計引物，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA或cDNA模板2.0 μL，Pfu酶1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個循環(huán);72 ℃延伸5 min。DNA和cDNA的PCR產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1. 2. 3 SlCMR1蛋白的生物信息學(xué)分析 利用ProtParam、SOSUI、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1和SignalP 5.0等在線工具對SlCMR1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。將SlCMR1在NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST中進(jìn)行同源性比對，得到不同物種SlCmr1基因的氨基酸序列，在GeneDoc中進(jìn)行多重序列比對，使用MEME分析3個相似度最高的Motif。使用MEGA 7.0對BLAST的結(jié)果進(jìn)行氨基酸序列多重比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 4 SlCmr1基因敲除載體的構(gòu)建 根據(jù)番茄匍柄霉SlCmr1基因的上、下游1000 bp左右的序列，各設(shè)計1對加入酶切位點的引物（表1）。構(gòu)建基因敲除載體的方法為在pCX62載體潮霉素基因的兩端分別插入SlCmr1基因的上、下游片段（圖1）。具體過程與方法：對SlCmr1基因的上、下游分別進(jìn)行PCR擴增（PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，上、下游引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，Pfu酶1.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個循環(huán);72 ℃延伸5 min），PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果正確的上、下游PCR產(chǎn)物（SlCmr1SY和SlCmr1XY）分別純化回收，紫外分光光度計測量濃度、檢測質(zhì)量。提取pCX62質(zhì)粒，分別將質(zhì)粒和下游PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切（BamH I和Xba I）處理，酶切體系10.0 μL：10×M Buffer 5.0 μL，限制性內(nèi)切酶各2.0 μL，DNA 2.0 μL（約400 ng/μL），ddH2O補足至10.0 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 4 h。將酶切產(chǎn)物分別用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用試劑盒進(jìn)行純化回收。T4連接酶連接回收的載體和下游酶切產(chǎn)物，連接體系20.0 μL：T4 Buffer 2.0 μL，T4酶1.0 μL，載體質(zhì)粒酶切純化產(chǎn)物1.0 μL（約100 ng/μL），下游酶切純化產(chǎn)物5.0 μL（約160 ng/μL）。反應(yīng)程序：22 ℃ 20 min，65 ℃ 10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗證。測序正確的載體質(zhì)粒（pCX62-SlCmr1XY）與上游PCR產(chǎn)物（SlCmr1SY）分別進(jìn)行雙酶切（Kpn I和Hind III）、連接轉(zhuǎn)化處理，體系與反應(yīng)程序同上，選擇測序正確的敲除載體pCX62-SlCmr1。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SlCmr1基因克隆結(jié)果

分別以番茄匍柄霉菌株CS12的DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物測序，得到SlCmr1基因的DNA全長為3275 bp，CDS長度為3018 bp（圖2）;在NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTn中將DNA序列與CDS序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示其存在3個內(nèi)含子。

2. 2 SlCMR1蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析結(jié)果

由ProtParam可知SlCmr1基因編碼蛋白序列全長1005 aa，理論等電點（pI）為6.64，分子式為C4882H7642 N1404O1499S61，分子量為111.94 kD，原子總數(shù)為15488，其帶有負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）97個，帶正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）92個。在理論數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上得出半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)58.72，親/疏水性平均值為-0.424（圖3），故推測其為不穩(wěn)定的可溶性蛋白。

2. 3 SlCMR1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

利用SMART在線預(yù)測網(wǎng)站分析SlCMR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，可得到其存在2個相鄰的ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域（Cys2His2 zinc finger：2～24 aa和30～52 aa）和1個GAL4結(jié)構(gòu)域[Zn（II）2Cys6：73～116 aa]（圖4-A）。在SOPMA中預(yù)測SlCMR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α-螺旋占34.93%，無規(guī)則卷曲占52.74%，延伸鏈占9.85%，β-折疊占2.49%（圖4-B）。在PSIPRED V4.0在線預(yù)測網(wǎng)站，使用SWISS-MODEL在線同源建模，對SlCMR1蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果證實其主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成（圖4-C），二者預(yù)測的結(jié)果一致。

2. 4 SlCMR1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

用SignalP 5.0在線網(wǎng)站分析S1CMR1蛋白，結(jié)果表明其可能含有信號肽的概率為0.11%，因此推測S1CMR1為非分泌蛋白;于TMHMM Server v.2.0在線預(yù)測網(wǎng)站中分析SlCMR1蛋白，發(fā)現(xiàn)其不含跨膜結(jié)構(gòu);WoLF PSORT在線預(yù)測，推測其定位在細(xì)胞核中。使用NetPhos 3.1在線預(yù)測分析，結(jié)果（圖5）顯示SlCMR1中共有130個分值在0.5以上可能發(fā)生磷酸化的氨基酸位點，其中絲氨酸磷酸化位點89個、蘇氨酸磷酸化位點35個、酪氨酸磷酸化位點6個。

2. 5 SlCMR1蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

SlCmr1基因編碼的蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp同源性搜索比對，得到不同物種的CMR1蛋白序列。將SlCMR1蛋白序列與番茄匍柄霉（Stemphylium lycopersici，KNG52672.1）、小麥根腐離孺孢（Bipolaris sorokiniana，KAF5844733.1）、稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae，XP 007683728.1）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica，XP 008022458.1）、蕓薹生鏈格孢（Alternaria brassicicola，AEN02471.1）、圓核腔菌（Pyrenophora teres，CAA9962123.1）、偃麥草核腔菌（Pyrenophora tritici-repentis，XP 0019336 51.1）、枝孢菌（Clathrospora，KAF1946502.1）、小檗葫蘆霉（Cucurbitaria berberidis，KAF1843946.1）、棘殼孢葉斑病菌（Pyrenochaeta sp.，OAL46131.1）、殼多孢屬（Stagonospora sp.，OAK99817.1）和多主棒孢霉（Corynespora cassiicola，PSN62609.1）中的同源序列在MEGA 7.0中進(jìn)行多重序列比對，比對結(jié)果采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖6）。同源性比對結(jié)果顯示，SlCMR1蛋白序列與數(shù)據(jù)庫中收錄的番茄匍柄霉CMR1蛋白序列僅相差1個氨基酸，推測為不同菌株間的差異。

使用GeneDoc將相似性最高的幾個物種的CMR1與SlCMR1蛋白進(jìn)行多重序列比對，并將兩相鄰的ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域和GAL4結(jié)構(gòu)域標(biāo)出（圖7），于MEME在線預(yù)測網(wǎng)站中將SlCMR1蛋白與其相似性最高的幾個蛋白序列進(jìn)行搜索，找到3個相似性最高的片段，并對其進(jìn)行標(biāo)注（圖8）。由圖8可見，SlCMR1蛋白與不同物種的CMR1蛋白間同源性較高的Motif區(qū)域分別為a（3～52 aa）、b（57～106 aa）和c（818～867 aa）等3處，其中，a中包括2個相鄰的ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域，b中含有GAL4結(jié)構(gòu)域，與保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析及多重序列比對結(jié)果一致。

2. 6 SlCmr1基因敲除載體構(gòu)建

用菌株CS12的DNA為模板，使用上游引物Cmr1SY-F、Cmr1SY-R和下游引物Cmr1XY-F、Cmr1XY-R分別擴增出SlCmr1基因的上、下游片段，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（圖9）。上、下游片段大小均與預(yù)期一致。將載體質(zhì)粒與下游片段進(jìn)行酶切、連接及轉(zhuǎn)化，挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，得到測序正確的含有下游片段的重組載體pCX62-SlCmr1XY。再將上游片段與重組載體pCX62-Sl-Cmr1XY進(jìn)行上述操作，得到測序正確的重組敲除載體pCX62-SlCmr1。

由于pCX62和上游片段中各有1個BamHⅠ酶切位點，因此將敲除載體pCX62-SlCmr1進(jìn)行BamHⅠ單酶切驗證（圖10），得到2條明亮的條帶，一條大小約為5000 bp，與pCX62載體、部分上游片段和下游片段相加的大?。?493 bp）相符，另一條帶的大小約為2000 bp，與部分上游片段和潮霉素B相加的大?。?971 bp）相符。單酶切驗證結(jié)果與重組載體測序結(jié)果一致，說明成功構(gòu)建了敲除載體pCX62-SlCmr1，后續(xù)可使用該載體進(jìn)行真菌遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步探究該基因的功能。

3 討論

Cmr1廣泛存在于真菌中，是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，但目前關(guān)于該轉(zhuǎn)錄因子功能的研究報道有限。有研究證明該轉(zhuǎn)錄因子及同源物正調(diào)控真菌中的黑色素合成，Cmr1基因敲除后，黑色素的合成被阻斷（Schumacher，2016;Luo et al.，2018），另有研究表明Cmr1基因敲除后不僅抑制黑色素合成，還增加了橙色色素合成（Eliahu et al.，2007;Cho et al.，2012）。鄭露（2010）發(fā)現(xiàn)引起大蒜白斑病的茄匍柄霉（S. solani）的致病力與其合成的橙色色素有關(guān)，該色素是一種非寄主?；远舅?。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)番茄匍柄霉的致病力也與病菌產(chǎn)生橙色色素的能力呈正相關(guān)，說明橙色色素可能是與匍柄霉致病有關(guān)的毒素。為了解番茄匍柄霉橙色色素合成的機制，本課題組前期對色素產(chǎn)生能力不同的番茄匍柄霉菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)SlCmr1基因在致病力弱的菌株中表達(dá)量低，這一結(jié)果與鏈格孢中Cmr1同源基因Amr1敲除后橙色色素增加，致病力增強（Eliahu et al.，2007;Cho et al.，2012）的報道矛盾。SlCmr1基因的功能如何，是否與橙色色素合成及致病力有關(guān)，尚缺乏深入了解。本研究從高產(chǎn)橙色色素的番茄匍柄霉菌株CS12中克隆得到SlCmr1的DNA序列及CDS序列，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SlCmr1基因編碼蛋白序列全長1005 aa，與NCBI數(shù)據(jù)庫中番茄匍柄霉的CMR1蛋白序列僅相差1個氨基酸，推測為不同菌株造成的差異。該蛋白包含2個相鄰的ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域和1個GAL4結(jié)構(gòu)域，是典型的轉(zhuǎn)錄因子。ZnF_C2H2的DNA結(jié)合基序最初在轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中發(fā)現(xiàn)并報道，與5S RNA基因的內(nèi)部控制區(qū)結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄（Miller et al.，1985）。GAL4含有Zn（II）2Cys6雙核簇DNA結(jié)合基序，是真菌轉(zhuǎn)錄因子所特有的結(jié)構(gòu)域（Todd and Andrianopoulos，1997）。Zn（II）2Cys6雙核簇基序的缺失能使黑色素完全丟失，而ZnF_C2H2的缺失僅會導(dǎo)致黑色素合成減少（Tsuji et al.，2000）。在敲除了Cmr1基因的玉米小斑病菌中調(diào)控黑色素合成相關(guān)基因BRN1、BRN2和SCD1的表達(dá)被完全抑制，而聚酮合成酶基因PKS18的表達(dá)量僅表現(xiàn)降低，同時發(fā)現(xiàn)Cmr1基因的正、負(fù)鏈均能轉(zhuǎn)錄，并受2個MAPK基因Chk1和Mps1的調(diào)控（Eliahu et al.，2007）。在產(chǎn)黑色素短梗霉（Aureobasidium melanogenum）XJ5?1菌株中，Cmr1與PKS1基因啟動子的TTCTCCA序列特異性結(jié)合，激活PKS1基因及黑色素合成相關(guān)基因T4HR1和SCD1的表達(dá)（Jiang et al.，2020）。說明在不同的真菌中，黑色素的合成可能由不同的聚酮合成酶（PKS）負(fù)責(zé)骨架的合成，其不同程度受Cmr1基因的調(diào)控。番茄匍柄霉產(chǎn)生橙色色素少的菌株中SlCmr1基因的表達(dá)量低，但其原因尚未明確。因此，本研究構(gòu)建了SlCmr1基因的敲除載體，為后續(xù)對番茄匍柄霉菌株進(jìn)行基因敲除以分析SlCmr1的功能打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

SlCmr1可能是真菌調(diào)控色素合成的關(guān)鍵基因，在真菌的次級代謝產(chǎn)物合成中發(fā)揮重要作用。本研究成功構(gòu)建了敲除載體pCX62-SlCmr1，為后續(xù)進(jìn)一步探討該基因在色素合成中的作用打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 麻小燕）