檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制動力學(xué)研究

宋菲 陳開健 唐敏敏 陳華 李永東

摘 ?要：為了研究檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，以75%乙醇為提取溶劑，利用超聲波輔助法提取檳榔多酚（檳榔籽和檳榔殼多酚），采用S-8大孔樹脂對粗提物進行純化，探討純化前后的檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，通過動力學(xué)實驗判斷對酶活性的抑制類型，同時對添加不同濃度檳榔多酚提取物的α-葡萄糖苷酶的熒光光譜和同步熒光光譜進行分析。結(jié)果表明：檳榔籽多酚提取物純化前后的IC50分別為（0.34±0.12）、（0.33±0.10） μg/mL，檳榔殼多酚提取物純化前后的IC50分別為（1.73±0.31）、（0.14±0.09）mg/mL，純化后的檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著增強。動力學(xué)實驗表明，檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用類型為競爭性與非競爭性的混合型抑制。熒光光譜和同步熒光光譜分析結(jié)果顯示，檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶內(nèi)源性熒光具有淬滅作用，但對酶的構(gòu)象沒有影響。檳榔籽和檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均較強，可為天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：檳榔多酚;純化;α-葡萄糖苷酶;活性抑制;動力學(xué);熒光淬滅

中圖分類號：S792.91 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： Areca seed and areca shell polyphenols were extracted using the ultrasonic assisted method with 75% ethanol as extraction solvent and purified by S-8 macropore resin. The inhibitory effect of polyphenol extracts from areca nut on α-glucosidase activity before and after purification was studied. The inhibitory type on α-glucosidase activity was determined by kinetic experiments， and the fluorescence spectrum and synchronous fluorescence spectrum of α-glucosidase with different concentrations of areca nut polyphenol extracts were analyzed. The results showed that the IC50 of areca seed polyphenol extracts before and after purification was （0.34±0.12） and （0.33±0.10）μg/mL， respectively， and the IC50 of areca shell polyphenol extracts before and after purification was （1.73±0.31） and （0.14±0.09）mg/mL， respectively， indicating that the inhibition on α-glucosidase activity was enhanced after purification of areca shell polyphenol extracts. Kinetic experiments showed that the inhibition of areca nut polyphenol extracts on α-glucosidase activity belonged to the mixed type of competition and non-competition. The fluorescence spectrum and synchronous fluorescence spectrum analysis showed that areca nut polyphenol extracts had quenching effect on the endogenous fluorescence of α-glucosidase， but had no effect on the conformation of α-glucosidase. In conclusion， areca seed and areca shell polyphenol extracts have good inhibitory effect on α-glucosidase activity， which could provide reference for the development of natural inhibitors of α-glucosidase.

Keywords： areca nut polyphenols; purification; α-glucosidase; activity inhibition; kinetics; fluorescence quenching

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.035

檳榔（Areca catechu L.）系棕櫚科（Palmae）熱帶作物，屬多年生常綠喬木，主要分布在中非和東南亞。我國海南、臺灣栽培較多，廣西、云南、福建等地也有栽培。檳榔作為海南省的主要特色經(jīng)濟作物，種植面積約有15.58萬hm2，據(jù)統(tǒng)計其初加工產(chǎn)值約有287.3億元，是海南省230 萬農(nóng)民的主要經(jīng)濟來源[1]。檳榔含有豐富的功能活性成分，如多酚、多糖、生物堿等，具有多種藥理作用[2]。但目前對檳榔功能活性物質(zhì)的研究及開發(fā)不足，嚴(yán)重制約了檳榔的高附加值利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

糖尿病是對人類身體健康有重大危害的主要疾病之一，近些年來患糖尿病的人數(shù)不斷地增加[3]?；继悄虿〉闹饕蚴遣秃蟾哐堑陌l(fā)生。而導(dǎo)致餐后高血糖發(fā)生的原因是人體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶水解多糖，釋放出葡萄糖致使人體血糖濃度的升高[4]。因此緩解及治療糖尿病患者的有效方法之一是尋找出對α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用的物質(zhì)，以達到對酶活性進行控制的目的[5]。目前用于臨床醫(yī)學(xué)治療的抑制劑有阿卡波糖、伏格列波糖等，這些人工合成的抑制劑長期服用對人體有毒副作用，常見的副作用有消化系統(tǒng)紊亂等[6-7]。因此，如果能尋找出一種安全、高效、毒性小的抑制劑對醫(yī)學(xué)治療糖尿病方面的發(fā)展是非常重要的。

近年來，從植物中提取能夠抑制α-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)，并進行分離純化、結(jié)構(gòu)及相關(guān)抑制作用機理的研究，是α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究熱點[8]。目前國內(nèi)外對檳榔多酚的研究主要集中在酚類物質(zhì)的提取工藝、抗氧化及抑菌活性等方面[9-10]，但關(guān)于檳榔多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制方面的相關(guān)研究較少。宋菲等[11]前期研究了檳榔水提物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，結(jié)果表明檳榔籽、檳榔殼、檳榔花水提物均對酶的活性具有抑制作用，尤其是檳榔籽和檳榔殼水提物，且水提物中含有多酚類物質(zhì)。因此，本研究以檳榔多酚（檳榔籽多酚和檳榔殼多酚）提取物為研究對象，采用體外酶抑制模型評價其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并通過S-8大孔樹脂對檳榔多酚提取物進行純化;在此基礎(chǔ)上，通過抑制動力學(xué)實驗，判斷酶活性抑制類型，同時研究檳榔多酚提取物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合性質(zhì)及其對酶構(gòu)象的影響，初步探討其作用機制，不僅可以為新型天然降血糖藥物及產(chǎn)品的開發(fā)提供參考，還可以為提高檳榔產(chǎn)品的附加值，促進檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科技支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?材料與試劑 ?新鮮檳榔果采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所的檳榔種質(zhì)資源圃，采收果齡為5～6個月，清洗表塵后晾干，并對半切開，60 ℃條件下干燥48 h，分別取檳榔殼、檳榔籽，采用粉碎機將其粉碎后，過24目篩，放入干燥器中備用。

α-葡萄糖苷酶（來源于釀酒酵母，酶活力為14.72 U/mg），美國 Sigma 公司;阿卡波糖、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、福林酚、S-8大孔樹脂，均為BR試劑，上海源葉生物科技有限公司;兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司;乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備 ?JA5003B電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DP-406DG 真空冷凍干燥機，無錫德普儀器制造有限公司;R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琪公司;Varioskan Flash全自動熒光免疫分析儀，美國Thermo Scientific公司;F-7000熒光分光光度計，日立高新技術(shù)公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?檳榔多酚的提取 ?分別取50.00 g的檳榔籽和檳榔殼樣品（m1），按料液比1∶10（W/V）加入75%乙醇，置于超聲波發(fā)生器中提取，提取條件為水浴溫度為60 ℃、頻率為40 kHz、時間為30 min，重復(fù)提取4次，之后用200目紗布過濾，再經(jīng)孔徑為0.45 μm的有機濾膜真空抽濾，然后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，濃縮物用超純水復(fù)溶后進行冷凍干燥，得到多酚提取物粉末并稱量質(zhì)量（m2）。多酚提取率采用如下公式計算：

1.2.2 ?檳榔多酚的純化 ?參考文獻[12]的方法，采用S-8大孔樹脂純化檳榔多酚提取物。稱取16.91 g樹脂，濕法裝柱（2 cm × 28 cm），將200 mL濃度為0.50 mg/mL的檳榔多酚粗提液，以4 BV/h的上樣流速過柱，吸附結(jié)束后用80 mL的蒸餾水洗去殘液，并用170 mL 60%濃度的乙醇以4 BV/h的洗脫流速進行洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使乙醇溶劑除去，得到純化后的檳榔多酚。

1.2.3 ?多酚含量的測定 ?稱取一定質(zhì)量的多酚提取物（m1），采用福林酚法測定提取物中的多酚含量（m2）[12]，結(jié)果以兒茶素當(dāng)量表示。測得兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0039x+ 0.0784，R2=0.9962，有效濃度范圍為0～100 μg/mL。多酚含量采用如下公式計算：

1.2.4 ?α-葡萄糖苷酶活性抑制率測定 ?采用文獻[11]中的方法，分別測定純化前后的檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.2.5 ?抑制動力學(xué)實驗 ?參考文獻[11]中的方法測定純化后的檳榔多酚提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)。其中，純化后的檳榔籽多酚提取物的濃度為0、0.2、0.4 μg/mL，純化后的檳榔殼多酚提取物的濃度為0、0.1、0.3 mg/mL。以酶濃度為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)變化速率V（A/min）為縱坐標(biāo)作圖，判斷抑制類型是否可逆。以底物PNPG的濃度Q的倒數(shù)（1/Q）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率V的倒數(shù)（1/V）為縱坐標(biāo)作圖，得到Lineweaver- Burk雙倒數(shù)曲線，以此判斷可逆抑制類型。

1.2.6 ?熒光光譜分析 ?準(zhǔn)確移取4.0 mL 待測溶液于1 cm 熒光池中，檢測其熒光光譜。α-葡萄糖苷酶溶液的終濃度為1 U/mL，純化后的檳榔籽多酚提取物的終濃度為0、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 μg/mL，純化后的檳榔殼多酚提取物的濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μg/mL?；旌暇鶆蚝笫覝叵伦饔? min，在激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長300～500 nm范圍內(nèi)掃描混合樣品的熒光光譜，激發(fā)光和發(fā)射光狹縫均為5.0 nm。

1.2.7 ?同步熒光光譜分析 ?準(zhǔn)確移取4.0 mL待檢溶液于1 cm熒光池中，檢測其同步熒光光譜。α-葡萄糖苷酶溶液的終濃度為1 U/mL，純化后的檳榔籽多酚提取物的終濃度為0、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 μg/mL，純化后的檳榔殼多酚提取物的濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35 μg/mL，混合均勻后室溫下作用5 min，分別以Δλ（激發(fā)波長與發(fā)射波長的距離）為15 nm和60 nm，掃描混合樣品在300～500 nm范圍內(nèi)的同步熒光光譜，狹縫為5.0 nm。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?檳榔多酚的含量

檳榔籽、檳榔殼的多酚提取率及多酚含量見表1。檳榔籽多酚提取率為（49.06±1.34）%、檳榔殼多酚提取率為（16.74±2.47）%。檳榔籽、檳榔殼提取物的多酚含量分別為（43.83±2.48）%、（3.00±0.08）%，結(jié)果表明，檳榔籽提取物中多酚含量顯著高于檳榔殼提取物中多酚含量（P<0.05）。經(jīng)S-8大孔樹脂純化后檳榔籽、檳榔殼提取物中多酚含量分別為（79.18±3.81）%、（27.27±1.76）%，較純化前均顯著提高，是未純化時的1.81倍、9.08倍。

2.2 ?檳榔多酚提取物對 α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

純化前后的檳榔籽、檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制實驗結(jié)果見圖1和表2。由圖1和表2可知，純化前后的檳榔籽多酚提取物均對α-葡萄糖苷酶活性抑制較顯著，抑制作用都優(yōu)于陽性對照阿卡波糖，純化前后的檳榔籽多酚提取物的IC50分別為（0.34±0.12）、（0.33±0.10） μg/mL、阿卡波糖的IC50為（0.71±0.09） mg/mL。檳榔殼多酚提取物純化前對酶的抑制作用比阿卡波糖弱，IC50為（1.73±0.31） mg/mL，純化后對酶的抑制作用顯著提高，效果強于阿卡波糖，IC50為（0.14±0.09）mg/mL。

2.3 ?檳榔多酚提取物對 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的動力學(xué)實驗

純化后的檳榔籽及檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的動力學(xué)實驗結(jié)果如圖2所示。判斷的方法是根據(jù)酶濃度與反應(yīng)變化速率得到的直線不過原點時，抑制類型為不可逆抑制。體系中得到的直線通過原點，但斜率小于不添加抑制劑時的直線斜率時，抑制類型為可逆抑制。由圖 2可知，體系中得到的直線都通過原點，因此，純化后的檳榔籽和檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用類型均為可逆抑制。

純化后的檳榔籽和檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲線如圖3所示，抑制動力學(xué)參數(shù)如表3所示。由圖3可知，純化后的檳榔籽及檳榔殼多酚提取物在不同作用濃度時的3條直線均相交于第二象限，且在此濃度范圍內(nèi)，隨著提取物濃度的不斷增大，Vmax不斷減少，Km不斷增大（表3）。這種現(xiàn)象表明，純化后的檳榔籽和檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均屬于競爭性與非競爭性的混合型抑制類型。

2.4 ?熒光光譜分析

純化后的不同濃度的檳榔籽多酚提取物（0～ 20 μg/mL）、檳榔殼多酚提取物（0～35 μg/mL）與α-葡萄糖苷酶作用以后，在285 nm激發(fā)波長下，分析熒光光譜的變化情況。純化的檳榔籽多酚及檳榔殼多酚對α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響結(jié)果如圖4所示。圖4表明，加入純化的檳榔籽及檳榔殼多酚提取物后，熒光強度有明顯的變化，即隨著濃度的不斷加大，熒光強度不斷降低，但波峰沒有發(fā)生位移。結(jié)果表明，檳榔籽及檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源性熒光具有淬滅作用，但對酶的構(gòu)象沒有太大的影響。

2.5 ?同步熒光光譜分析

為60 nm或15 nm時，顯示的是色氨酸殘基、酪氨酸殘基的熒光光譜特性。通過掃描加入不同濃度的樣品在=60 nm和=15 nm時的同步熒光光譜，分析樣品對α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)的影響。

α-葡萄糖苷酶中加入純化后的不同濃度的檳榔籽多酚提取物（0～20 μg/mL）或檳榔殼多酚提取物（0～35 μg/mL）進行掃描，得到的同步熒光光譜結(jié)果見圖5和圖6。從圖中可以看出，α-葡萄糖苷酶溶液中檳榔籽或檳榔殼多酚提取物濃度的不斷增大會使其熒光強度不斷減小，但最大熒光強度沒有發(fā)生紅移或藍移。結(jié)果表明，加入檳榔多酚提取物后，酪氨酸與色氨酸殘基熒光同時被淬滅，且色氨酸殘基熒光減小的程度較酪氨酸更大。表明檳榔多酚提取物與α-葡萄糖苷酶發(fā)生了相互作用，其結(jié)合位點可能更接近色氨酸殘基，但對酶的構(gòu)象變化無影響。

3 ?討論

目前對檳榔降血糖活性物質(zhì)方面的研究主要集中在檳榔堿[13-15]，檳榔多酚提取物降血糖方面的研究較少。田雪芬[16]研究了不同方法制備的檳榔青果提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，結(jié)果顯示，70%乙醇提取物抑制率相對較高，IC50為（29.26±1.70）μg/mL，遠(yuǎn)低于本文中檳榔籽多酚提取物對酶活性的抑制率，但并未進一步研究提取物中主要是哪些成分起作用以及具體的作用機理是什么。Huang等[17]研究表明，檳榔中的酚類物質(zhì)原花青素有可能通過調(diào)節(jié)鏈脲佐菌誘導(dǎo)的小鼠糖異生相關(guān)激酶的表達來改善高血糖癥?？梢姡瑱壚圃诮笛腔钚苑矫婢哂泻芎脩?yīng)用的潛力。

本研究提取了檳榔多酚（檳榔籽、檳榔殼多酚），并采用S-8大孔樹脂進行了純化，結(jié)果表明，純化前后檳榔籽多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比阿卡波糖強;而檳榔殼多酚在純化前比阿卡波糖弱，但純化后對酶的抑制作用提高，效果優(yōu)于阿卡波糖。上述結(jié)果提示，檳榔多酚可能通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性進而發(fā)揮降血糖的功能。

抑制劑對酶的抑制類型有2種，分別為可逆抑制和不可逆抑制[18]，判斷依據(jù)為抑制劑與酶結(jié)合特點的不同。本研究的結(jié)果表明，純化后的檳榔籽及檳榔殼多酚提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制類型均屬于可逆抑制，表明其與酶的結(jié)合方式為非共價鍵結(jié)合。這種抑制作用可通過物理方法使酶的活性得到恢復(fù)。可逆抑制類型又分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。研究結(jié)果表明，純化后的檳榔籽及檳榔殼多酚提取物對酶的抑制類型為競爭性與非競爭性的混合型可逆抑制。該結(jié)果與文獻中竹葉椒乙醇提取物[19]、芳姜黃酮及其衍生物[20]對α-葡萄糖苷酶的抑制類型不同，它們是競爭性抑制。與前期的檳榔籽和檳榔殼的水提物[11]研究結(jié)果相同。通過對熒光光譜分析可知，純化后的檳榔籽多酚和檳榔殼多酚對α-葡萄糖苷酶內(nèi)源性熒光具有淬滅作用，但對酶的構(gòu)象沒有太大影響。同步熒光光譜分析結(jié)果也表明，其對α-葡萄糖苷酶中的酪氨酸和色氨酸殘基都沒有影響。

本研究結(jié)果表明，檳榔多酚對α-葡萄糖苷酶具有很好的抑制作用，對于檳榔在新型天然、高效降糖藥物的開發(fā)應(yīng)用方面具有重要意義。普義鑫[21]對S-8大孔樹脂純化的檳榔多酚進行了結(jié)構(gòu)鑒定，表明蘆丁、綠原酸、表兒茶素、沒食子酸是檳榔多酚中的組分;祁靜等[22]研究了檳榔殼多酚的組分，確定其中含有（-）-表兒茶素、（+）-兒茶素、柚皮素、山奈素、阿魏酸、綠原酸等。據(jù)報道這些多酚類物質(zhì)都具有一定的抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性，但其對α-葡萄糖苷酶的抑制率均低于本研究中的檳榔籽多酚提取物。因此，對于檳榔多酚提取物中主要發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的單體活性化合物是什么，其結(jié)構(gòu)分析和不同的酚類物質(zhì)之間的協(xié)同作用，以及對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用機理都有待進一步深入的研究。

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責(zé)任編輯：崔麗虹