菠蘿MYB基因AcoMYB1的克隆與表達分析

李穆 蔡元保 楊祥燕 黃思婕 李季東 譚秦亮 邱文武 方位寬

摘 ?要：根據(jù)菠蘿轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果克隆到1個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AcoMYB1，GenBank登錄號為XM_020230319。該基因cDNA全長1221 bp，開放閱讀框（ORF）為747 bp，編碼一個含有248個氨基酸的蛋白。序列分析表明，AcoMYB1氨基酸序列N端具有2個保守的SANT結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子。生物信息學(xué)分析表明，AcoMYB1是不穩(wěn)定的親水蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，可能定位于細胞質(zhì)，二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。實時熒光定量PCR分析表明，AcoMYB1在菠蘿干旱、低溫逆境脅迫處理下受誘導(dǎo)表達，整體上表現(xiàn)出“先升后降”的趨勢;在早熟品種和晚熟品種的果實發(fā)育過程中也被誘導(dǎo)表達，表現(xiàn)為“升-降-升”的趨勢，特別是在果實發(fā)育早期和果實成熟后期受誘導(dǎo)表達的強度較為突出。由此推測AcoMYB1作為正調(diào)控因子參與菠蘿冷害、干旱逆境脅迫的響應(yīng)過程，并在菠蘿果實早期發(fā)育及后期成熟發(fā)揮調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：菠蘿;MYB基因;基因表達;果實發(fā)育;逆境脅迫

中圖分類號：S668.3 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： A MYB transcription factor gene， belonging to R2R3， was cloned by the results of the transcriptome se-quencing of pineapple （Ananas comosus）， which was named AcoMYB1 and the GenBank accession number was XM_020230319. The full length cDNA and coding region （ORF） was 1221 bp and 747 bp， encoding 248 amino acids with two conserved SANT domains at N-terminal. By bioinformatics analysis， AcoMYB1 was an unstable hydrophilic protein without transmembrane structure and signal peptide， which may be located in the cytoplasm， and the secondary structure mainly had alpha helixes and random coils. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that AcoMYB1 was induced by drought and low temperature stress， and showed a trend of “up first then down”， and the expression was also induced in the fruit development of early and late maturing varieties， which showed a tendency of “up-down-up”， especially in the early stage of fruit development and the later stage of fruit maturation. Therefore， it is speculated that AcoMYB1 as a positive regulatory factor is involved in the response process of chilling injury and drought stress， and plays a regulatory role in the early fruit development and late fruit maturation of pineapple （Ananas comosus）.

Keywords： Ananas comosus; MYB genes; gene expression; fruit development; adversity stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.002

MYB轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，一般具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和不完全界定的負調(diào)節(jié)區(qū)3個保守功能域[1]。其中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域最為保守，一般由1～4個不完全重復(fù)的R基序（R1、R2和R3）組成，每個R基序約有52個氨基酸殘基[2]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域特征可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB共4個亞家族，其中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最豐富的轉(zhuǎn)錄因子類型之一[3-4]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)功能，幾乎參與了植物各種生長發(fā)育和代謝過程，并在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[5]，這對于闡明植物抗逆分子機制及其遺傳改良具有重要意義。

在MYB轉(zhuǎn)錄因子中，關(guān)于1R-MYB亞家族成員的功能研究相對較少，1R-MYB在調(diào)節(jié)植物生物鐘、維持染色體結(jié)構(gòu)完整性，以及調(diào)控DNA結(jié)合蛋白上起重要作用[6-7]。R2R3-MYB亞家族可能是由R1R2R3-MYB亞家族基因丟失了一個R1基序演化形成[8]，且是數(shù)量最多的MYB轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥（Arabidopsis thaliala）有130多個，水稻（Oryza sativa）有109個，葡萄（Vitis vinifera）有117個，大豆（Glycinemax）有244個，玉米（Zea mays）有157個等[9]。R2R3-MYB亞家族的相關(guān)功能研究在MYB轉(zhuǎn)錄因子中也較多，R2R3-MYB是參與新陳代謝途徑最廣泛的一類，主要通過調(diào)控基因表達而發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物細胞形態(tài)建成、生長發(fā)育等系列生理過程中發(fā)揮重要作用[10]，如棉花GhMYB9和GhMYB146能夠調(diào)控棉花纖維的發(fā)育[11-12]，擬南芥AtMYB37、AtMYB38和AtMYB84能夠調(diào)控其側(cè)分生組織的形態(tài)建成[13]，楊樹PtrMYB3和PtrMYB20參與了次生木質(zhì)部的生物合成[14]，大豆GmMYB181調(diào)控其生殖器官的發(fā)育[15]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子也能調(diào)控初級、次級代謝產(chǎn)物的生物合成，如擬南芥、葡萄等植物中多個R2R3-MYB基因調(diào)控類黃酮生物合成[16]、苯丙烷代謝途徑[17-18]以及花青素的生物合成等[19-20]。此外，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)控蛋白，能夠響應(yīng)生物和非生物脅迫以提高植物的抗逆性[5， 21]，如AtMYB44通過調(diào)控EIN2增強擬南芥對菜蛾和桃蚜的抗蟲性[22]，野生大豆GsMYB15異源過表達能夠增強轉(zhuǎn)基因擬南芥對棉鈴蟲和鹽脅迫的抗性[23]，OsMYB91通過調(diào)控SLR1的表達提高水稻的耐鹽性[24]，OsMYB3R-2轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱、抗寒和耐鹽性有明顯提高[25]，煙草NtMYB44b能夠響應(yīng)MeJA、GA、ABA激素處理及干旱脅迫[26]，馬鈴薯StMYB44通過負調(diào)控StPHO1應(yīng)對低磷脅迫[27]。

菠蘿（Ananas comosus）又稱鳳梨，是世界四大熱帶水果之一，其風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外消費者的青睞。目前，陳哲等[28]從菠蘿基因組中篩選鑒定出103個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，并分析其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白和系統(tǒng)進化，Liu等[29]對菠蘿全基因組的R2R3-MYB特征和逆境下的表達情況做了分析。而基于轉(zhuǎn)錄組信息分析菠蘿R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究鮮為報道。因此，本研究從菠蘿轉(zhuǎn)錄組中篩選和克隆獲得1個誘導(dǎo)表達顯著上調(diào)的R2R3-MYB基因，并通過生物信息學(xué)方法和RT-qPCR分析對其生物學(xué)特性與功能進行研究，以期為闡明菠蘿R2R3-MYB基因在響應(yīng)冷害、干旱逆境脅迫及其在果實發(fā)育中的分子機制提供理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?植物材料和處理

試驗材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西亞熱帶作物研究所菠蘿種質(zhì)資源圃提供的‘金菠蘿（MD-2）品種、‘巴厘（Comte de Paris）早熟品種和‘pérola晚熟品種。分別對苗齡為60 d的‘金菠蘿組培苗進行20%濃度的PEG6000干旱脅迫和4 ℃低溫脅迫處理，處理時間分別設(shè)為0、1、3、6、12、24 h，其中0 h處理的植株作為對照，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，采集相應(yīng)的葉片。在早熟品種‘巴厘謝花（從第1朵自然開花的小花算起，下同）后20、35、50、60、65、70 d分別采集果肉，在晚熟品種‘pérola謝花后20、40、60、80、100、120 d分別采集果肉。以上所有材料取樣后進行液氮速凍，保存于?80 ℃超低溫冰箱中，并迅速提取總RNA。

1.2 ?菠蘿AcoMYB1基因的cDNA克隆

參照蔡元保等[30]的CTAB改良法提取菠蘿葉片和果肉的總RNA，并按照Fermentas（MBI）反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進行cDNA第1鏈合成。利用本課題組從菠蘿轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得1個MYB基因，根據(jù)其EST序列設(shè)計開放閱讀框ORF的擴增引物AcoMYB1-F和AcoMYB1-R（表1），并獲得菠蘿AcoMYB1基因的最大開放閱讀框ORF序列，所用引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 ?生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的Blast程序進行蛋白質(zhì)序列的同源檢索，用ORF Finder查找最大開放閱讀框ORF，用SMART軟件預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域，用ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，用PSORT軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞定位，用SignalP軟件預(yù)測信號肽，用TMpred軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)段，用SOPMA軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，用Swiss-model軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)（表2）。在NCBI網(wǎng)站進行蛋白同源比對，并用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 ?菠蘿AcoMYB1基因表達分析

采用實時熒光定量RT-qPCR方法分析菠蘿AcoMYB1基因的表達情況，AcoMYB1基因的特異引物為QP-F和QP-R，菠蘿內(nèi)參基因為18S rRNA基因，引物為Q18S-F和Q18S-R（表1）。通過RT-qPCR分析菠蘿AcoMYB1基因在品種‘金菠蘿幼苗期分別經(jīng)干旱（20% PEG6000）和低溫（4 ℃）處理0、1、3、6、12、24 h，以及早熟品種‘巴厘謝花后20、35、50、60、65、70 d和晚熟品種‘pérola謝花后20、40、60、80、100、120 d的表達情況。RT-qPCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃預(yù)變性30 s，58.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s;72 ℃延伸5 min，18S rRNA和AcoMYB1循環(huán)數(shù)分別為20和30。每個試驗設(shè)3次重復(fù)，采用2?ΔΔCT方法分析處理數(shù)據(jù)，確定AcoMYB1基因的相對表達量。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?菠蘿AcoMYB1基因的克隆

以菠蘿品種‘金菠蘿cDNA第1鏈為模板，AcoMYB1-F和AcoMYB1-R為開放閱讀框ORF的擴增引物。通過RT-PCR擴增和序列分析表明，菠蘿AcoMYB1基因的cDNA全長序列為1221 bp，ORF長為747 bp，編碼一個含248個氨基酸的蛋白質(zhì)。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序進行蛋白質(zhì)序列同源檢索顯示，AcoMYB1蛋白含有典型的MYB結(jié)構(gòu)域，屬于MYB蛋白。因此，將該基因命名為AcoMYB1，GenBank登錄號為XM_020230319。

2.2 ?AcoMYB1蛋白的多序列比對

經(jīng)過多序列比對分析表明（圖1），AcoMYB1蛋白與海藻、油棕、石刁柏等其他植物來源的MYB家族蛋白具有較高的相似性，即氨基酸序列相似性均在60%以上。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明，AcoMYB1蛋白N端含有2個保守的SANT結(jié)構(gòu)域，屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子的R2R3亞家族蛋白，其中第1個高度保守的SANT結(jié)構(gòu)域含有51個氨基酸殘基（第11～61位），第2個高度保守的SANT結(jié)構(gòu)域含有49個氨基酸殘基（第64～112位），而非保守序列主要集中于C端。

AcoMYB1：菠蘿（XP_020085908.1）;MYBAS1-like isoform X1：海藻（XP_008795797.1）;MYBAS1：

油棕（XP_029123914.1）;MYBAS2-like isoform X2：石刁柏（XP_020276648.1）;MYBAS1-like：

鐵皮石斛（XP_020682892.2）;MYB59-like isoform X2：蝴蝶蘭（XP_020583391.1）。

AcoMYB1： Ananas comosus （XP_020085908.1）; MYBAS1-like isoform X1： Sargassum （XP_008795797.1）; MYBAS1： Elaeis guineensis （XP_029123914.1）; MYBAS2-like isoform X2： Asparagus officinalis （XP_020276648.1）; MYBAS1-like： Dendrobium officinale （XP_020682892.2）; MYB59-like isoform X2： Phalaenopsis （XP_020583391.1）.

2.3 ?AcoMYB1蛋白特性及結(jié)構(gòu)分析

通過ProtParam軟件分析AcoMYB1蛋白的理化性質(zhì)顯示，AcoMYB1蛋白的相對分子量為28.25 kDa，理論等電點（pI）為5.93，不穩(wěn)定系數(shù)為72.77，親水平均數(shù)為?0.892，因此，推測AcoMYB1蛋白為不穩(wěn)定親水酸性蛋白。PSORT軟件分析表明，AcoMYB1蛋白可能定位于細胞質(zhì)。SignalP軟件和TMpred軟件預(yù)測表明，AcoMYB1蛋白不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。SOPMA軟件分析結(jié)果顯示（圖2），AcoMYB1蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要含有α-螺旋（47.58%）和無規(guī)則卷曲（40.32%），其次是折疊延伸鏈（7.26%）和β-轉(zhuǎn)角（4.84%），且AcoMYB1蛋白2個保守的SANT結(jié)構(gòu)域（R2和R3）主要含有α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

利用Swiss-model軟件基于同源建模預(yù)測AcoMYB1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，以明確其蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征。以WER轉(zhuǎn)錄因子2B的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：6kks.1A）為同源模板，構(gòu)建AcoMYB1蛋白的三維預(yù)測模型。AcoMYB1蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的結(jié)果表明（圖3），AcoMYB1蛋白的氨基酸序列與模板序列一致性為54.55%，覆蓋率為44%，GMQE值為0.36，QMEAN4值為0.87，主要以單體形式存在，無配體;而且獲得的R2、R3：2個保守的SANT結(jié)構(gòu)域。

AcoMYB1蛋白三維模型與MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)域高度相似，主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲構(gòu)成2個保守的SANT結(jié)構(gòu)域（即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域R2和R3），這與AcoMYB1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符合。

2.4 ?AcoMYB1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定菠蘿AcoMYB1蛋白在MYB轉(zhuǎn)錄因子中的系統(tǒng)進化地位，將來源于不同植物共16個MYB典型蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。分析結(jié)果表明（圖4），MYB蛋白可明顯分為4個進化分支，其中AcoMYB1與月季MYB59 isoform X1、蘋果和罌粟MYB59-like isoform X1和石刁柏MYBAS2-like isoform X2的親緣關(guān)系較近，具有相同的進化起源，推測他們具有類似的結(jié)構(gòu)和功能;與菠蘿MYBAS1-like、蝴蝶蘭MYB59-like isoform X2和扁桃MYB59的親緣關(guān)系較遠。

2.5 ?菠蘿AcoMYB1基因在不同脅迫和果實不同發(fā)育時期的表達分析

以菠蘿18S rRNA為參照基因，利用實時熒光定量PCR分析菠蘿AcoMYB1基因在不同脅迫和果實不同發(fā)育時期的表達情況。不同脅迫條件下的表達結(jié)果表明（圖5），AcoMYB1基因在幼苗期經(jīng)4 ℃低溫脅迫和PEG模擬的干旱脅迫后，葉片中的表達量都有明顯提高，隨著時間延長誘導(dǎo)表達的效果越明顯，整體上表現(xiàn)出“先升后降”的趨勢，推測該基因參與菠蘿冷害、干旱逆境脅迫響應(yīng)。在果實不同發(fā)育時期的表達結(jié)果表明（圖6），早熟品種‘巴厘和晚熟品種‘pérola果實發(fā)育成熟過程中，AcoMYB1基因均被誘導(dǎo)表達， 都表現(xiàn)為“升-降-升”的表達趨勢，尤其在果實發(fā)育早期和果實成熟后期受誘導(dǎo)表達的強度比較突出，推測該基因在菠蘿果實早期發(fā)育及后期成熟發(fā)揮調(diào)控作用。

3 ?討論

本研究克隆獲得了1個菠蘿MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為AcoMYB1。氨基酸序列分析表明，AcoMYB1具有R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子特有的2個高度保守SANT結(jié)構(gòu)域（R2和R3），這與陳哲等[28]研究結(jié)果一致。多序列比對分析顯示，AcoMYB1與海藻、油棕、石刁柏等其他植物來源的MYB家族蛋白相似性均在60%以上，表明R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子在進化過程中非常保守。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析顯示，AcoMYB1蛋白為不穩(wěn)定親水酸性蛋白，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易溶解。這與R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子其他成員的研究結(jié)果一致[23-24]。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，AcoMYB1與MYB59成員的親緣關(guān)系最近，具有相同的進化起源，推測他們具有類似的結(jié)構(gòu)和功能，為進一步研究AcoMYB1的功能特征奠定基礎(chǔ)。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子作為植物重要的調(diào)控蛋白，能夠響應(yīng)非生物脅迫以提高植物的抗逆性[5， 21]。在非生物脅迫下，擬南芥AtMYB60和AtMYB96能夠響應(yīng)干旱脅迫[31];番茄SpMYB和小麥TaODORANT1能夠響應(yīng)多種非生物脅迫，都能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐旱性[32-33];過表達SlMYB41的轉(zhuǎn)基因番茄耐旱性顯著高于野生型植株[34]。這些已報道的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子大多作為正調(diào)控因子，其表達受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo)。本研究中實時熒光定量PCR分析表明，AcoMYB1基因在幼苗期經(jīng)4 ℃低溫脅迫和PEG模擬的干旱脅迫后，葉片中的表達量都有明顯提高。由此推測AcoMYB1作為正調(diào)控因子，參與菠蘿冷害、干旱逆境脅迫的響應(yīng)過程。

此外，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育等系列生理過程中同樣發(fā)揮重要作用[10]。在果實發(fā)育成熟過程中，不同品種的草莓FaMYB5基因[35]、辣椒中茄科特有MYB基因MYB31[36]、櫻桃pacMYBA基因[37]等都大量表達，尤其是后期的表達量明顯高于前期，推測這些基因參與果實發(fā)育成熟及其代謝產(chǎn)物的生物合成。本研究中實時熒光定量PCR分析表明，在早熟品種和晚熟品種果實發(fā)育成熟過程中，AcoMYB1基因都大量表達，在果實發(fā)育早期和果實成熟后期受誘導(dǎo)表達的強度比較突出，推測該基因在菠蘿果實早期發(fā)育及后期成熟發(fā)揮調(diào)控作用。至于AcoMYB1基因是否調(diào)控菠蘿果實代謝產(chǎn)物的生物合成還有待于進一步研究。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最豐富的轉(zhuǎn)錄因子類型之一，是改良植物遺傳特性的良好基因資源，可為植物抗逆育種提供一種新的技術(shù)途徑。本研究表明，AcoMYB1基因可能參與菠蘿逆境脅迫響應(yīng)以及果實發(fā)育成熟的調(diào)控，但其具體的生物學(xué)功能還需采用亞細胞定位、酵母單雜交及遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)進一步驗證。

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