聚酰胺—大孔樹脂聯(lián)用純化菠菜葉總黃酮的工藝研究

郭彩珍　褚盼盼　喬元彪

摘 要：采用聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用法對菠菜葉中總黃酮的純化條件進行研究。以總黃酮的純度和得率為考察指標，確定純化菠菜葉總黃酮的最佳樹脂為AB-8，其最佳純化條件為：上樣量與聚酰胺量之比為1∶2；上樣量與樹脂量之比為1∶8；乙醇洗脫的濃度為60%；洗脫流速為2 mL·min-1；洗脫劑的用量為2BV?？傸S酮得率最高可達71.42%，純度可達26.63%。

關(guān)鍵詞：菠菜葉；總黃酮；純化；聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用

中圖分類號：S636.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.017

Study on Enriching Total Flavonoids from Spinach Leaves with Polyamide and Macroporous Resin

GUO Cai-zhen，CHU Pan-pan， QIAO Yuan-biao

（Department of Biology， Lyuliang University， Lyuliang， Shanxi 033000， China）

Abstract： Purigying total flavonoids from spinach leaveswith polyamide and macroporous resin was studying in this paper.Purity and yield of total flavonoids as investigates index.The best purified resin of total flavonoids in spinach leaves was AB-8，The optimum experimental conditions were：the best ratio of absorbing solution and polyamide was 1：2；the best ratio of absorbing solution and resin was 1：8；ethanol concentration was 60%；the eluting velocity was 2 mL·min-1；the dosage of the eluting solution was 2BV.The yield of total flavonoids reached to 71.42% and the purity was 26.23%.

Key words： spinach leaves；total flavonoids；purification；combination polyamide and macroporous resin

黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)生的一種天然產(chǎn)物，近年來研究報道了黃酮類化合物具有抗菌、降血糖血脂、抗腫瘤、抗氧化性、防治心腦血管疾病等豐富的藥理活性[1-3]。蔬菜中黃酮類化合物的含量在0.21～6.44 mg·g-1，而且主要存在于葉中。葉菜中的黃酮類化合物含量遠大于莖菜、果菜和根菜[4-7]。菠菜的葉片厚實而且葉肉多，所以含有較多的黃酮類化合物，具有較高的研究價值。目前對菠菜葉片的研究主要集中在色素及提取方面，很少涉及菠菜葉中黃酮類化合物的純化。本試驗首次用聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用對菠菜葉中總黃酮的純化進行了初步研究，以期為其進一步的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

菠菜葉片：將新鮮的菠菜葉片洗凈，置于60 ℃的恒溫干燥箱中干燥，粉碎機粉碎備用。

1.2 試劑與儀器

試劑：石油醚、纖維素酶、無水乙醇、蘆丁標準品、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉鹽酸（HCl） 以上試劑均為分析純；D4020、AB-8、S-8、X-5 大孔吸附樹脂；聚酰胺。

儀器：電子天平：上海電子儀器；層析柱：上海玻璃儀器廠；高速萬能粉碎機：天津市泰斯儀器有限公司；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；DGH-9053A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 總黃酮提取物的制備及含量測定 稱菠菜葉片粉末適量，用石油醚脫脂后加10倍原料質(zhì)量的蒸餾水混勻，按酶用量為6.5 mg·g-1，在46 ℃和pH值4.7的條件下進行纖維素酶預(yù)處理1.5 h，然后再加入20倍原料的70%乙醇溶液在70 ℃下恒溫浸提2次，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮干燥，備用。總黃酮的含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法測定 [8]，以蘆丁作標準品，在510 nm的波長下測其吸光值，再繪制標準曲線，并計算回歸方程：Y=0.123 6X+0.004 4，式中X為總黃酮的濃度（mg·mL-1），Y為吸光度值。

1.3.2 大孔樹脂及聚酰胺粉末預(yù)處理 稱取一定量的大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24 h，再用酒精洗直至與3倍的蒸餾水混合不會變渾濁，然后用蒸餾水洗到無酒精味，取出備用[9]。

稱取適量的聚酰胺粉末用無水乙醇煮沸2次，每次0.5 h，然后用濕法裝柱，靜置0.5 h再用蒸餾水洗，直到洗出液變?yōu)槌吻澹瑐溆谩?/p>

1.3.3 不同型號大孔樹脂的篩選 取預(yù)處理好的等量不同型號的大孔樹脂用濕法裝柱（1 cm×20 cm），再用甲醇溶解5份0.5 g的總黃酮提取物，分別拌入1 g處理好的聚酰胺粉末，溶劑揮干后放置于漏斗中，用蒸餾水洗脫到流出液近無色，再將洗脫后的聚酰胺分別置于不同型號的大孔樹脂柱上面，用60%乙醇溶液洗脫至無色。分別測定洗脫液中的固體量及其總黃酮的含量，計算總黃酮的得率和純度?？傸S酮得率（%）=（洗脫液中所含總黃酮量/上柱前提取物所含總黃酮量）×100%，總黃酮純度（%）=（洗脫液中所含總黃酮量/洗脫液含固體量）×100%；表1列出了不同型號各樹脂的結(jié)構(gòu)性能。

1.3.4 上樣量與聚酰胺用量比的確定 稱取試驗最佳的樹脂5 g，濕法裝柱。再分別稱0.5 g的總黃酮提取物，用甲醇溶解后拌合以一定量的聚酰胺粉末，使提取物與聚酰胺用量比分別為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1，水洗至無色后置樹脂柱上部，以60%乙醇進行洗脫，收集各比例的洗脫液并測其相應(yīng)指標。

1.3.5 上樣量與樹脂用量比的確定 稱取0.5 g的總黃酮提取物，以提取物與樹脂用量為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的比例進行濕法裝柱。按已確定的上樣量與聚酰胺最佳比例進行處理后用60%乙醇進行洗脫，收集各比例的洗脫液并測定其相應(yīng)指標。

1.3.6 洗脫劑濃度的確定 稱取0.5 g的總黃酮提取物，按上述已確定的上樣量與聚酰胺最佳比例和上樣量與樹脂最佳比例上樣后，分別用20%，40%，60%，80%的乙醇濃度洗脫，收集各濃度的洗脫液并測定其相應(yīng)指標，確定最佳洗脫劑的濃度。

1.3.7 洗脫流速的確定 稱取0.5 g的總黃酮提取物按已確定最佳的上樣量與聚酰胺比例、上樣量與樹脂比例和洗脫劑濃度上樣后，用60%的乙醇分別以1，2，3，4 mL·min-1的流速洗脫，收集各流速的洗脫液并測定其相應(yīng)指標，確定最佳的洗脫速度。

1.3.8 洗脫劑用量的確定 稱取預(yù)處理好的AB-8樹脂4 g用濕法裝柱，將其處理好的總黃酮提取物按上述最佳條件上樣和洗脫，進行分段收集，每5 mL收集一份，共收集20份，然后測其總黃酮含量及相應(yīng)指標并繪制其洗脫曲線，從而確定洗脫劑的最佳用量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同型號大孔樹脂的篩選

由于聚酰胺分子篩和大孔樹脂吸附的雙重作用，聚酰胺初步純化的供試液進入大孔樹脂后將會進行更進一步的純化。不同樹脂的吸附性能和物理性質(zhì)不同，對所需有效成分吸附的影響較大。由表2可以看出，在四種樹脂中AB-8樹脂純化和富集總黃酮的純度及得率方面的效果最佳，因此，本試驗選用AB-8樹脂與聚酰胺聯(lián)用進行純化。

2.2 上樣量與聚酰胺用量比分析

由表3可知，隨著上樣量-聚酰胺用量比不斷增大，在洗脫液中總黃酮的純度和得率逐漸降低。這可能是因為聚酰胺的用量降低以后，在聚酰胺上吸附的雜質(zhì)和總黃酮的量相應(yīng)減少，同時在水洗脫除雜的過程當中，流失了大量的總黃酮所致。所以綜合考慮總黃酮的純度和得率，本試驗選擇1∶2的上樣量與聚酰胺用量比。

2.3 上樣量與樹脂用量比分析

由表4可知，上樣量一定時，上樣量與樹脂用量比為1∶8時總黃酮的純度和得率都達到最大值。若樹脂用量過少，就會超過樹脂的飽和吸附量而使部分總黃酮損失而引起總黃酮的純度和得率降低；隨著樹脂量不斷增多，純度和得率的變化不是很大，但是會使純化的周期變長，生產(chǎn)成本也就相應(yīng)的增高。所以最佳的上樣量與樹脂用量比例為1∶8。

2.4 乙醇洗脫濃度的確定

乙醇濃度對洗脫液中總黃酮的純度和得率都有一定的影響。表5結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮的純度和得率也逐漸升高，當乙醇濃度為60%時達到最高值；當乙醇的濃度大于60%后，總黃酮的純度和得率變化趨于平緩，說明翅果油樹葉片中的總黃酮已經(jīng)基本被洗脫下來。考慮到洗脫劑的浪費，本實驗選擇用60%的乙醇為洗脫劑。

2.5 洗脫流速的確定

表6表明，洗脫流速為2 mL·min-1時，總黃酮的純度和得率達到最大，能將總黃酮較完全的洗脫下來。當流速過快時，洗脫劑和樹脂接觸的時間比較短，樹脂對洗脫劑中總黃酮的吸附率降低而導致其純度和得率都下降；但當流速較慢時，則會使洗脫循環(huán)的周期變長，浪費洗脫劑。所以本試驗選擇2 mL·min-1的洗脫流速。

2.6 洗脫劑用量的確定

在洗脫的過程中，若洗脫劑用量較少，所需的成分就不會被完全洗脫下來，若洗脫劑較多則會造成試驗成本的升高，也會給后續(xù)的濃縮干燥等處理帶來困難。由表7可知，當洗脫劑的用量大于2 BV以后，總黃酮的得率變化不是很大反而純度有所降低，絕大部分的總黃酮已經(jīng)在2 BV時基本被洗脫下來。本著縮短時間和減少試驗周期的原則，本試驗選擇2 BV的洗脫劑用量。

3 結(jié) 論

聚酰胺和大孔樹脂是純化黃酮類化合物的常用材料，由于二者吸附原理不同使其在分離純化黃酮類化合物方面各有優(yōu)缺點，但是把聚酰胺和大孔樹脂聯(lián)用就能充分發(fā)揮其優(yōu)點。本試驗采用聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用純化菠菜葉總黃酮的最佳樹脂為AB-8，其最佳純化條件為：上樣量與聚酰胺量之比為1∶2；上樣量與樹脂量之比為1∶8；乙醇洗脫的濃度為60%；洗脫流速為2 mL·min-1；洗脫劑的用量為2 BV，總黃酮收率最高可達71.42%，純度可達26.63%。該方法優(yōu)于目前常用的總黃酮的純化方法且工藝簡單，具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1] 魯曉翔.黃酮類化合物抗氧化作用機制研究進展[J].食品研究與進展，2012，33（3）：220-224.

[2] 周寶利，姚婷，張健，等.苦參黃酮對黃瓜枯萎病及抗性生理的影響[J].華北農(nóng)學報，2009（6）：78-82.

[3] Middleton J R.Biological properities of plant flavonoid：anoverview[J].Int J P Harmacognos， 1996（34）：344-348.

[4] 趙娟娟.響應(yīng)面法優(yōu)化提取菠菜中黃酮類物質(zhì)的工藝研究[J].北方園藝，2013（14）：137-139.

[5] 楊建興，宋曙輝，王文琪，等.幾種特色蔬菜抗氧化作用的研究[J].安徽農(nóng)學通報，2009，15（3）：43-45.

[6]劉江，胡筱波，郝強，等.洋蔥皮總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2011（6）：153-156，160.

[7] 李眾飛.黃瓜藤中黃酮的提取工藝研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2005（1）：20-21.

[8] 衛(wèi)強，戴一，吳燕，等.聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用純化菊葉總黃酮的初步研究[J].中藥材，2011，34（8）：1 285-1 288.

[9] 余丹妮，徐德生，馮怡，等.聚酰胺-大孔樹脂聯(lián)用富集益母草總黃酮[J].中國中藥雜志，2008，33（33）：264-268.