利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定茉莉花基因組大小和染色體倍性

李春牛 李先民 黃展文 盧家仕 李琴 黃昌艷 卜朝陽

摘 ?要：以收集的16份茉莉花資源及50份實(shí)生種質(zhì)為材料，以玉米B73為內(nèi)參，采用流式細(xì)胞術(shù)估測茉莉花基因組大小，并以二倍體品種為對照，計(jì)算茉莉花染色體倍性。結(jié)果表明：內(nèi)參與待測樣品峰值能完全分開，無重疊峰，峰型清晰集中，可對茉莉花基因組大小進(jìn)行有效估測;供試材料中有56份二倍體，基因組大小為0.54～0.63 Gb，有7份三倍體，基因組大小為0.79～0.96 Gb，有3份四倍體，基因組大小為1.04～1.12 Gb;從收集的資源中鑒定出二倍體和三倍體，未見四倍體，而從實(shí)生種質(zhì)中鑒定出3個(gè)四倍體、2個(gè)三倍體，表明實(shí)生選種是茉莉花種質(zhì)創(chuàng)新的一條有效途徑;在已明確花冠類型的材料中，三倍體及四倍體均為單瓣型茉莉。該研究結(jié)果為茉莉花倍性育種及實(shí)生選種提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茉莉花;流式細(xì)胞術(shù);基因組大小;染色體倍性;實(shí)生選種

中圖分類號：S961.6 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Using Zea mays ‘B73 as the internal reference， the genome size of 66 Jasminum sambac germplasm （16 col-lected germplasms and 50 seedings） were estimated by the flow cytometry， and the ploidy was calculated using diploid as the control. Using Zea mays ‘B73 as the internal parameter could effectively estimate the genome size of J. sambac， the peaks of the samples under test could be separated completely， and no overlapping peaks and peaks could be clearly concentrated. 56 germplasms were diploid with genome size between 0.54 Gb and 0.63 Gb， Seven germplasms were triploid with genome size between 0.79 Gb and 0.96 Gb， Three germplasms were tetraploid with genome size range from 1.04 Gb to 1.12 Gb. Three tetraploid and two triploid were found in the seedings， which showing that seed selec-tion is an effective way of germplasm innovation for J. sambac. All the tetraploid and triploid blossomed were simple flower. The results of the study wouldl provide important reference basis for the ploidy breeding and seed selection of J. sambac.

Keywords： Jasminum sambac; flow cytometry; genome size; ploidy; seedling selection

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.005

茉莉花Jasminum sambac （L.） Ait.系木犀科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum）植物，原產(chǎn)于印度，現(xiàn)在我國南方和世界各地均有廣泛栽培，可用于花茶加工、香精提取、觀賞及藥用等[1]。我國規(guī)?；N植茉莉花主要用于花茶加工，全國種植面積為12 300 hm2，年產(chǎn)鮮花為120 600 t，年產(chǎn)茉莉花茶為110 800 t[2]。根據(jù)花冠層數(shù)，茉莉花一般分為單瓣茉莉、雙瓣茉莉及多瓣茉莉。單瓣茉莉花香型較好，多瓣茉莉花花冠大、花瓣多，觀賞性更好。長期以來，我國茉莉花規(guī)?；N植品種單一，長期無性繁殖，品性退化、產(chǎn)量和質(zhì)量不斷下滑[3]，茉莉花育種迫在眉睫。

茉莉花自然結(jié)實(shí)低[4-6]。Thompson等[5]研究認(rèn)為素馨屬多個(gè)種自交不親和，生產(chǎn)上大規(guī)模種植單一品種，導(dǎo)致不結(jié)實(shí)。張澤岑[7]認(rèn)為茉莉花花粉活力差、胚敗育導(dǎo)致生殖障礙十分嚴(yán)重。Nair等[8]研究不同產(chǎn)地的20份茉莉花粉粒形狀、萌發(fā)孔數(shù)目和外壁紋飾等特征，發(fā)現(xiàn)茉莉花粉的形態(tài)在進(jìn)化上相對保守。鄧衍明等[9]研究認(rèn)為，通過花粉萌發(fā)率計(jì)算和花粉管長度測量，可最大限度地反映茉莉花粉的育性水平和生理狀況。阮玉娟[10]采用秋水仙素誘導(dǎo)雙瓣茉莉獲得四倍體突變體。李春牛等[3]開展茉莉花60Co-γ射線輻照誘變育種研究，并獲得誘變材料。隨著茉莉花育性研究及育種工作的開展，茉莉花染色體倍性準(zhǔn)確鑒定顯得尤為重要。王湘平等[11]研究表明，雙瓣茉莉花為二倍體，染色體核型公式2n=2x=26=8 m+16 sm+ 2 sm（SAT）。Datta[4]通過染色體觀察發(fā)現(xiàn)2個(gè)二倍體（2n=26），1個(gè)三倍體（2n=39）。George等[12]對2份茉莉花材料進(jìn)行染色體觀察，發(fā)現(xiàn)1個(gè)二倍體和1個(gè)三倍體茉莉花，未發(fā)現(xiàn)其他多倍體。目前，我國多數(shù)茉莉花品種資源染色體的倍性尚不明確，不僅影響茉莉花育性研究、倍性育種和雜交育種工作的開展，也影響育種策略的選擇。傳統(tǒng)的染色體倍性鑒定主要是染色體觀察法[13-14]和形態(tài)觀察法[15]，前者準(zhǔn)確性高，但操作復(fù)雜、技術(shù)難度大、工作量大，后者主要根據(jù)多倍體的巨大型特點(diǎn)，準(zhǔn)確性較差。近年來，流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）已成為植物倍性鑒定、基因組大小測定等研究的重要工具[16]。流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析、分選的技術(shù)，對處于液流中各種熒光標(biāo)記的微粒進(jìn)行多參數(shù)快速準(zhǔn)確地定性、定量測量[17]。因其快速、靈敏及可同時(shí)進(jìn)行倍性鑒定和基因組大小估測等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[18-19]，已經(jīng)成功用于蓮瓣蘭和墨蘭[20]、文心蘭[21]、香蕉[22]、杏[23]、桑樹[24]、柑橘[15]等植物染色體倍性鑒定。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定16份茉莉花資源及50份實(shí)生種質(zhì)的基因組大小和染色體倍性，并探討染色體倍性與茉莉花花冠類型的關(guān)系，為茉莉花種質(zhì)創(chuàng)新和倍性育種研究提供參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料包括16份收集的茉莉花種質(zhì)資源、50株自然結(jié)實(shí)種子苗。供試材料種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所茉莉花資源圃，管理和栽培環(huán)境基本一致。對照品種為二倍體‘橫縣雙瓣茉莉花。內(nèi)參為玉米B73（Zea mays ‘B73），基因組大小為2.3 Gb，以種子萌發(fā)后1個(gè)月的嫩葉為試驗(yàn)材料，其種子取自中國科學(xué)院昆明植物研究所。流式細(xì)胞儀由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)，型號為BD FACScalibur。

1.2 ?方法

1.2.1 ?細(xì)胞懸浮液制備 ?采集供試種質(zhì)的嫩葉為試驗(yàn)樣品。參考田新民等[17]的方法配制MGb解離液。將樣品置于0.8 mL預(yù)冷的MGb解離液中，用鋒利的刀片將組織迅速垂直切碎，使其在解離液中冰上靜置10 min，然后用400目濾網(wǎng)過濾得到細(xì)胞核懸浮液。在細(xì)胞核懸液加適當(dāng)體積的預(yù)冷的碘化丙啶（PI）（母液濃度1 mg/mL）和適當(dāng)體積的RNAase溶液（母液濃度1 mg/mL），置于冰上避光染色0.5～1.0 h。PI染液和RNAase溶液的工作濃度均為50 μg/mL。

1.2.2 ?流式細(xì)胞儀檢測 ?將待測樣品的懸液和內(nèi)參樣品的懸液按適當(dāng)比例混合。利用流式細(xì)胞儀對染色后的細(xì)胞核懸浮液樣品上機(jī)檢測，采用488 nm藍(lán)光激發(fā)，檢測碘化丙啶的發(fā)射光熒光強(qiáng)度，每次檢測至少收集10 000個(gè)細(xì)胞顆粒，變異系數(shù)（CV）控制在5%以內(nèi)。

1.2.3 ?基因組大小及倍性計(jì)算 ?待測樣品DNA含量=內(nèi)參DNA含量（待測樣品的熒光強(qiáng)度/內(nèi)參樣品的熒光強(qiáng)度）。待測樣品的倍性=已知品種的倍性（待測樣品的DNA含量/已知品種的DNA含量）。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Modifit 3.0軟件分析和制圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?流式細(xì)胞倍性鑒定

以玉米B73為內(nèi)參，采用內(nèi)參法對茉莉花DNA含量進(jìn)行測定，待測樣品與內(nèi)參樣品同時(shí)進(jìn)行檢測。圖1展示部分樣品DNA含量測定的直方圖，分別為二倍體‘橫縣雙瓣茉莉、三倍體‘越南單瓣茉莉、四倍體（F15001）。內(nèi)參與待測樣品峰值能完全分開，無重疊峰，峰型清晰集中。表明以玉米B73為內(nèi)參測定茉莉花DNA含量具有可行性。

2.2 ?收集資源的倍性分析

對收集的16份茉莉花資源DNA含量進(jìn)行測定，根據(jù)內(nèi)參及待測樣品的熒光強(qiáng)度（表1），計(jì)算出待測樣品的基因組大小為0.56～0.96 Gb，其中對照品種二倍體‘橫縣雙瓣茉莉基因組大小為0.6 Gb。根據(jù)待測資源的基因組大小與對照基因組大小的關(guān)系，計(jì)算出待測茉莉花染色體倍性。結(jié)果表明，所收集的16份資源中有11份為二倍體，基因組大小為0.56～0.63 Gb;‘常規(guī)單瓣茉莉‘越南單瓣茉莉‘圓葉單瓣茉莉‘筆尖茉莉及‘泰國單瓣茉莉等5份茉莉花種質(zhì)資源為三倍體，基因組大小為0.86～0.96 Gb（表1）。收集的茉莉花種質(zhì)有二倍體和三倍體，未見四倍體。

2.3 ?實(shí)生種質(zhì)的倍性分析

對50份實(shí)生種質(zhì)DNA含量進(jìn)行測定（表2），計(jì)算出待測樣品的基因組大小為0.54～1.12 Gb。以二倍體‘泰國雙瓣茉莉?yàn)閷φ?，?jì)算出實(shí)生種質(zhì)的染色體倍性。共鑒定出二倍體45份、三倍體2份、四倍體3份。其中，從三倍體‘越南單瓣茉莉的3份實(shí)生種質(zhì)中鑒定出四倍體2份，三倍體1份。三倍體‘圓葉單瓣茉莉的1株實(shí)生苗鑒定為三倍體。從二倍體‘橫縣雙瓣茉莉的30份實(shí)生種質(zhì)中鑒定出二倍體29份，四倍體1份。二倍體‘泰國雙瓣茉莉的11株實(shí)生苗鑒定為二倍體。二倍體‘柬埔寨雙瓣茉莉的4株實(shí)生苗鑒定為二倍體。二倍體品種‘緬甸尖瓣茉莉的1株實(shí)生苗鑒定為二倍體。

從茉莉花實(shí)生種質(zhì)中獲得二倍體、三倍體和四倍體，豐富了茉莉花種質(zhì)的染色體倍性，表明實(shí)生選種是一種有效的茉莉花育種途徑。

2.4 ?染色體倍性與花冠的關(guān)系分析

已觀測到46份材料的花冠類型，單瓣茉莉10份，雙瓣茉莉28份，多瓣茉莉8份（表1、表2）。二倍體中有單瓣茉莉、雙瓣茉莉及多瓣茉莉，而5份三倍體及1份四倍體均為單瓣茉莉。染色體倍性增加，茉莉花花冠輪數(shù)并未增加，反而呈減少趨勢，出現(xiàn)了多倍體的花冠輪數(shù)比二倍體少的現(xiàn)象。

3 ?討論

流式細(xì)胞術(shù)可通過內(nèi)參和外參法進(jìn)行細(xì)胞核DNA含量測定。內(nèi)參法可避免因樣品的差異、機(jī)器的不穩(wěn)定等因素造成的誤差。通過內(nèi)參法測定細(xì)胞核DNA含量時(shí)，內(nèi)參細(xì)胞核DNA含量須已知且穩(wěn)定，最好與待測樣本細(xì)胞核DNA含量相近[17]，內(nèi)參樣本峰不能與待測樣本峰重疊，最好與待測樣本的G2或M期峰值不重疊[25]。目前較常用的植物內(nèi)參有雞紅細(xì)胞核[20， 26]（參考基因組大小1.20 Gb）、玉米B73[27]（參考基因組大小2.30 Gb）、番茄[28]（參考基因組大小0.94 Gb）、豌豆[17]（參考基因組大小4.64 Gb）等。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)待測茉莉花材料存在多種倍性，最大的基因組在1 Gb左右，玉米B73能與所有的待測樣品完全分開，與內(nèi)參樣品的G2和M期峰值不重疊，玉米B73為內(nèi)參測定茉莉花DNA含量是可行的。

植物基因組大小能為其進(jìn)一步的基因組學(xué)研究和進(jìn)化生物學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)[29]。茉莉花分子生物學(xué)方面的研究起步較晚，研究報(bào)道主要集中于分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳多樣性分析、香氣物質(zhì)合成相關(guān)酶基因的克隆等方面[30-33]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，基因組大小成為基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的本底資料[20]。Suda等[34]鑒定了素馨屬的Jasminum odoratissimum的C值為1.41 Gb，未見茉莉花DNA含量的相關(guān)研究報(bào)道。本研究估算出茉莉花基因組大小在0.54～1.12 Gb，為后續(xù)茉莉花基因組學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究提供參考。

對茉莉花染色體倍性進(jìn)行測定，是研究茉莉花生殖發(fā)育、開展雜交育種或倍性育種工作的基礎(chǔ)。本研究對66份茉莉花材料進(jìn)行染色體倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)56份二倍體、7份三倍體、3份四倍體。基于染色體倍性水平茉莉花種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。但值得注意的是，3份四倍體均來自實(shí)生種質(zhì)。收集的種質(zhì)資源只發(fā)現(xiàn)二倍體及三倍體，未發(fā)現(xiàn)其他多倍體，這與Datta[4]、George等[12]的研究結(jié)果一樣。茉莉花生殖障礙十分嚴(yán)重，雜交育種進(jìn)展緩慢。雖然茉莉花自然結(jié)實(shí)率低，但廣西茉莉花種植面積近7 000 hm2，每年仍然能獲得相當(dāng)數(shù)量的種子[35]。本研究中，從5個(gè)品種的50份實(shí)生種質(zhì)中鑒定獲得三倍體2個(gè)，四倍體3個(gè)。因此，實(shí)生選種是茉莉花育種的一種有效途徑。

多倍體是植物進(jìn)化的一種方式，其外觀形態(tài)、生理生化指標(biāo)等一般發(fā)生巨大的改變[36]，花、果通常均比二倍體大。阮玉娟[10]利用秋水仙素誘變二倍體茉莉花獲得四倍體突變體，發(fā)現(xiàn)突變體花瓣加厚且數(shù)目增加。本研究中，有5份三倍體、1份四倍體共計(jì)6份多倍體茉莉花已確定花冠類型，均表現(xiàn)為單瓣型茉莉花，而二倍體中有雙瓣茉莉、多瓣茉莉型，出現(xiàn)多倍體花冠輪數(shù)和花冠裂片數(shù)目比二倍體少的現(xiàn)象。這可能是不同種或不同基因型對染色體倍性變異的反應(yīng)不同，表型變異不同[37-38]。茉莉花染色體倍性增加不一定能獲得花冠層數(shù)多、花徑大的多瓣型茉莉花，這為選擇茉莉花育種策略提供參考。茉莉花多倍體外觀形態(tài)、生理生化指標(biāo)的變化有待進(jìn)一步研究。

致謝 ?流式細(xì)胞儀檢測及數(shù)據(jù)分析得到了中國科學(xué)院昆明植物研究所賈艷霞高級工程師的指導(dǎo)和幫助，特此致謝。

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