pH敏感的納米羥基磷灰石基電荷反轉型給藥系統(tǒng)的制備

楊志杰，李梓權，劉天宇，黃銳輝，嚴志紅，劉 意，，3*

（1.廣東藥科大學 醫(yī)藥化工學院，廣東 中山 528458；2.廣東藥科大學 藥學院，廣東 廣州 510006；3.中山安康德美生物科技有限公司，廣東 中山 528437）

化療是治療癌癥的主要方法之一，但是大多數(shù)化療藥物［如阿霉素（DOX）］都缺乏對腫瘤細胞的選擇性，導致了其對正常組織的毒副作用和低生物利用度［1］。隨著腫瘤納米醫(yī)學的發(fā)展，刺激響應型給藥系統(tǒng)被應用于提高化療藥物的遞送效率［2］。電荷反轉型給藥系統(tǒng)在血液循環(huán)中保持中性或負電荷，可以減少血漿蛋白的非特異性吸附，避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）清除，從而延長體內(nèi)循環(huán)時間；當通過高通透性和滯留（EPR）效應滲透進入腫瘤微環(huán)境后，能在某些刺激（如異常表達的酶、弱酸性等）的作用下提高表面電荷，使帶正電荷的納米粒與帶負電荷的腫瘤細胞靜電結合，促進腫瘤細胞的攝取［3］。羥基磷灰石（HA）作為骨骼和牙齒的主要無機成分，具有良好的生物相容性和生物降解性，同時其對部分藥物（如DOX、阿莫西林）有良好的載藥性能，因此被廣泛用作藥物載體［4-6］。此外，納米羥基磷灰石（nHA）具有廣譜的抗腫瘤活性，其抗腫瘤活性的特征是對腫瘤細胞有選擇性毒性，對正常細胞無影響［7-9］，因此常將nHA用作癌癥化療藥物載體。本工作以3-（2-氨基乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷（AAPS）作為nHA的表面改性劑，得到表面帶有正電荷的納米粒3-（2-氨基乙基）-氨丙基三甲氧基硅烷改性的納米羥基磷灰石（nHA-AAPS），加載化療藥物DOX制備正電荷的內(nèi)核，然后通過靜電作用組裝負電荷的外殼二甲基馬來酸酐改性的殼寡糖（COS-DMA），得到nHA基電荷反轉給藥系統(tǒng)（DOX@nHA-AAPS/COS-DMA）。采用透射電子顯微鏡（TEM）、X射線衍射（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等方法進行表征，為電荷反轉給藥系統(tǒng)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要原料

檸檬酸，四水硝酸鈣，磷酸氫二鈉十二水合物，二甲基馬來酸酐（DMA），牛血清白蛋白（BSA）：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司；殼寡糖（COS），分析純，相對分子質(zhì)量小于等于2 000，上海易恩化學技術有限公司；AAPS，化學純，九鼎化學科技有限公司；DOX，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

H-7650型透射電子顯微鏡，日本日立株式會所日立制作所；D/MAX2200型X射線粉末衍射儀，日本理學儀器株式會社；V-sorb 2800P型比表面積及孔徑分析儀，北京金埃譜科技有限公司；IR Affinity-1型傅里葉變換紅外光譜儀，UV-2600型紫外分光光度計：日本島津制作所；AvanceⅡ型核磁共振光譜儀，瑞士布魯克公司；Nano ZS90型納米粒度及Zeta電位儀，英國馬爾文公司。

1.3 nHA的制備

碳量子點（CQDs）的制備：將16 g檸檬酸溶于240 mL去離子水中，于180 ℃水熱反應5 h，用透析袋（截留分子量為1 000）透析24 h，冷凍干燥，得到CQDs。

nHA的制備：將0.12 g CQDs溶于180 mL去離子水中，加入4 mmol四水硝酸鈣，攪拌溶解，用1 mol/L NaOH溶液將溶液的pH值調(diào)節(jié)至12.0。逐滴滴加20 mL 0.12 mol/L磷酸氫二鈉溶液，室溫攪拌6 h。離心，分離出沉淀，用去離子水洗滌數(shù)次，干燥，即采用共沉定法得到了nHA。

1.4 DOX@nHA-AAPS的制備

nHA-AAPS的制備：將0.1 g nHA分散于30 mL甲苯中，滴加80 μL AAPS，在氮氣的保護下，于80 ℃攪拌5 h。離心，分離出沉淀，真空干燥，得到nHA-AAPS。

DOX的加載：將20 mg nHA-AAPS分散于1 mL去離子水中，加入10 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的DOX溶液，室溫攪拌24 h。離心，分離出沉淀，冷凍干燥，得到DOX@HA-AAPS。收集并測量上清液在480 nm的吸光度，根據(jù)標準曲線（見圖1）A= 0.018 44CDOX+0.007 3（A為吸光度，a.u.；CDOX為DOX的質(zhì)量濃度，μg/mL，下同）計算載藥量和包封率，見式（1）和式（2）。

圖1 DOX的吸收光譜和標準曲線Fig.1 Absorption spectrum and standard curve of DOX

1.5 DOX@nHA-AAPS/COS-DMA的制備

COS-DMA的制備：將1 g COS溶于30 mL二甲基亞砜（DMSO）中，加入1.57 g（相當于COS的氨基2倍物質(zhì)的量DMA），再加入0.3 mL三乙胺和0.3 mL吡啶作為催化劑，室溫攪拌24 h。反應完畢，在pH值為8～9的水溶液中透析2 d，冷凍干燥，得到COS-DMA。

DOX@nHA-AAPS/COS-DMA的制備：將10 mg DOX@nHA-AAP分散到等體積不同濃度的COSDMA溶液中，室溫攪拌6 h。離心，用去離子水洗滌數(shù)次，真空干燥，得到DOX@nHA-AAPS/COSDMA。

1.6 測試與表征

nHA的形貌和粒徑采用透射電子顯微鏡觀察；比表面積和孔徑分布采用比表面積及孔徑分析儀測試；納米粒的結構采用XRD，F(xiàn)TIR和核磁共振氫譜（1H-NMR）表征；DOX@nHA-AAPS/COS-DMA的電荷反轉特性采用英國馬爾文公司的Nano ZS90型納米粒度儀及Zeta電位儀測試。

蛋白吸附率測試：以BSA為模型，評價DOX@nHA-AAPS/COS-DMA對血漿蛋白的非特異性吸附行為［10］。BSA用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液配制成0.1 mg/mL，加入DOX@nHA-AAPS/COS-DMA并將其質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至0.15 mg/mL，于37 ℃孵育2 h。離心，小心收集上清液，測量上清液在280 nm處的吸光度，按式（3）計算蛋白吸附率。

式中：At表示經(jīng)DOX@nHA-AAPS/COS-DMA處理后上清液中BSA的吸光度；A0表示BSA的初始吸光度。

藥物的累計釋放率測試：10 mg DOX@nHAAAPS/COS-DMA分散到2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，轉移至透析袋（截留分子量3 500），再將透析袋置于50 mL不同pH值的PBS中，于37 ℃恒溫振蕩。分別于預定的時間吸取溶液5 mL，同時補充新的PBS 5 mL，測定溶液在480 nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線（見圖1）計算釋放的DOX質(zhì)量和藥物的累計釋放率，見式（4）和式（5）。

2 結果與討論

2.1 nHA的表征

從圖2可以看出：nHA為類球形納米粒，粒徑約為20 nm，較為均一。對比純HA晶體的標準卡片，衍射角為25.879°，31.773°，39.818°，46.711°，49.468°，53.143°處的衍射峰分別對應于純HA晶體的（002），（211），（310），（222），（213），（004）晶面，且無其他衍射峰出現(xiàn)，表明nHA中有HA晶體，且是純HA晶體。經(jīng)測試，nHA的比表面積為145 m2/g；孔徑集中分布在3~5 nm，孔徑分布與CQDs的粒徑分布一致［11］，表明模板CQDs的去除產(chǎn)生了介孔結構，介孔結構的存在增加了比表面積，提供了更多的藥物加載位點。

圖2 nHA的TEM照片和XRD圖譜Fig.2 TEM image and XRD patterns of nHA

2.2 DOX@nHA-AAPS/COS-DMA的表征

從圖3a可以看出：963，1 039，1 100 cm-1處為PO43-的伸縮振動峰，是HA的特征峰；經(jīng)AAPS改性后，2 932，1 582，1 327 cm-1處為AAPS中的C—H，N—H，C—N的伸縮振動峰，表明AAPS修飾到nHA表面；加載DOX后，DOX結構中蒽環(huán)上酮羰基的C=O出現(xiàn)在1 621 cm-1處，同時1 211，1 284 cm-1處出現(xiàn)了O—H的峰；當加載DOX的納米粒與COS-DMA靜電結合后，出現(xiàn)了3 376 cm-1處羧基的吸收峰，這是由于DMA分子中存在羧基。從圖3b可以看出：化學位移為1.72，1.76處的信號峰源于DMA上的甲基，結合FTIR圖譜中C=C的存在，均表明COS-DMA的合成［12-13］。從圖3c可以看出：nHA表面為負電荷（Zeta電位為-5.12 mV），這是由于HA晶體表面的OH-和導致的；經(jīng)過AAPS表面改性后，Zeta電位轉變?yōu)檎担?.13 mV），這主要是AAPS中氨基的存在；加載DOX后，DOX中的氨基提高了Zeta電位（4.30 mV）；當靜電結合負電荷的COS-DMA后，Zeta電位急劇降至-28.40 mV。上述結果表明，經(jīng)表面修飾，實現(xiàn)了表面為負電荷的DOX@nHAAAPS/COS-DMA的合成。

圖3 DOX@nHA-AAPS/COS-DMA的FTIR，1H-NMR及Zeta電位Fig.3 FTIR spectra，1H-NMR spectra and zeta potentials of DOX@nHA-AAPS/COS-DMA

2.3 電荷反轉特性和蛋白吸附

從圖4可以看出：組裝了負電荷外殼（COSDMA）后的納米粒均具有電荷反轉特性。納米粒在生理環(huán)境的pH值條件下保持負電荷，表面負電荷隨著COS-DMA用量的增加而明顯降低，其中，DOX@nHA-AAPS與COS-DMA質(zhì)量比超過1.000∶1.000后，Zeta電位趨于平穩(wěn)，因此將兩者質(zhì)量比確定為1.000∶1.000。在腫瘤微環(huán)境的pH值（為6.5）條件下表面電荷轉變?yōu)檎?，穩(wěn)定在6.00～7.00 mV。納米粒的表面電荷對化療藥物的遞送有明顯影響，在生理環(huán)境的pH值（為7.4）條件下保持表面負電荷，減少了被正常組織攝取和RES清除，有利于納米粒通過EPR效應蓄積在腫瘤部位；在腫瘤微環(huán)境的pH值條件下，由于負電荷外殼中酰胺鍵的水解，DMA分子的脫去，其表面電荷轉變?yōu)檎?，促進了腫瘤細胞對納米粒的攝取，提高了藥物的遞送效率［13-14］。

圖4 DOX@nHA-AAPS/COS-DMA的電荷反轉特性Fig.4 Charge reversal characteristics of DOX@nHA-AAPS/COS-DMA

由于DOX@nHA-AAPS表面為正電荷，因此具有較高的蛋白吸附率。當其結合帶負電荷的COSDMA后，負電荷表面降低了血漿蛋白的非特異性吸附，吸附率降至13%；在腫瘤弱酸性的pH值條件下，表面電荷由負值轉變?yōu)檎?，因此蛋白吸附率增?2%。電荷反轉特性降低了納米粒在血液循環(huán)中對血漿蛋白的非特異性吸附，延長體內(nèi)循環(huán)時間，有利于增加納米粒在腫瘤部位的分布和提高化療藥物的遞送效率。

2.4 藥物的加載和釋放

DOX@nHA-AAPS/COS-DMA中的DOX的最大載藥量為26.86%，包封率為91.80%。以不同的pH值模擬人體內(nèi)的不同部位組織的理化環(huán)境變化，即分別以pH值為7.4，6.5，5.5代表血液與正常組織、腫瘤組織間液和溶酶體的pH值。從圖5可以看出：DOX的釋放具有pH響應性，其累計釋放率隨著pH值的降低而增加，有利于提高化療藥物的遞送效率。在生理環(huán)境（pH=7.4）的條件下，DOX具有低的累計釋放率，在24 h內(nèi)的累計釋放率僅為2.89%，表明該給藥系統(tǒng)能明顯減少藥物在血液循環(huán)中的藥物泄漏，有利于降低化療藥物的毒副作用；pH值為6.5，5.5時，其累計釋放率明顯增加，具有腫瘤部位的定位釋放特性。pH響應性釋放的特性主要源于nHA在pH值為7.4時能保持晶體結構的穩(wěn)定，在pH值小于6.5的弱酸性條件下能被緩慢降解，加載于nHA晶體中的藥物被逐漸釋放；pH值的降低提高了nHA被降解的速率，因此藥物的釋放速率提高［15］。

圖5 DOX在不同pH值下的釋放曲線Fig.5 Release curves of DOX at different pH values

3 結論

a）以CQDs為模板，通過共沉淀法可以制備具有介孔結構和較高比表面積的nHA。

b）經(jīng)AAPS表面改性、DOX加載和COS-DMA的組裝，實現(xiàn)了表面為負電荷的DOX@nHAAAPS/COS-DMA的合成。DOX@nHA-AAPS/COSDMA具有電荷反轉特性和低蛋白吸附率，有利于降低血漿蛋白的非特異性吸附，從而延長體內(nèi)循環(huán)時間，增加納米粒在腫瘤部位的蓄積，促進細胞攝取。

c）DOX@nHA-AAPS/COS-DMA具有pH響應性釋放的特性，有利于減少此類給藥系統(tǒng)的藥物泄漏，減少藥物副作用，提高藥物的遞送效率。