蛋白酶水解美味牛肝菌工藝優(yōu)化及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性

黃 典，高 雅，劉 蕾，章慧鶯, ，張玉玉，陳海濤，孫寶國，曾 艷

（1.北京工商大學輕工科學技術學院，北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048；2.國家合成生物技術創(chuàng)新中心，天津 300308）

美味牛肝菌（Boletus edulisBull.Fr.）又名白牛肝、大腳菇，是產(chǎn)量最多，最具經(jīng)濟價值的牛肝菌品種之一[1]。美味牛肝菌具有很高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、氨基酸以及多種微量元素[2]。同時也具有很好的藥用價值，在抗炎、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等方面都有重要作用[3]。目前美味牛肝菌產(chǎn)品形式單一，附加值低，在收購及加工過程中會產(chǎn)生大量殘次品、菇柄及碎屑，造成極大的環(huán)境污染和資源浪費[4]。研究美味牛肝菌的精細加工對于美味牛肝菌資源的綜合利用具有重要意義。

食用菌是一種高蛋白、低脂肪的優(yōu)質(zhì)蛋白原料，是天然生物活性蛋白和多肽的重要來源[5?11]。與動植物蛋白原料相比，食用菌蛋白酶解制備抗氧化產(chǎn)物的研究并沒有受到太多關注[12?16]。美味牛肝菌干制樣品蛋白質(zhì)含量高達35%左右，可作為各類蛋白與多肽產(chǎn)品的原材料。目前對于美味牛肝菌抗氧化活性的研究仍主要集中在多糖、黃酮、多酚、甾體及萜類等生物活性成分[17]，其蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的相關研究尚未見報道。

本文以美味牛肝菌為原料，利用蛋白酶制備具有抗氧化活性的酶解產(chǎn)物。以DPPH·清除率和水解度為指標，在單因素實驗的基礎上采用響應面分析法優(yōu)化制備工藝，并對其抗氧化性質(zhì)進行測定，旨在為酶解工藝在美味牛肝菌精深加工中的應用提供理論依據(jù)，改善美味牛肝菌抗氧化產(chǎn)品品質(zhì)，提高美味牛肝菌產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干制美味牛肝菌（蛋白質(zhì)31.6 g/100 g，脂肪1.8 g/100 g，灰分7.2 g/100 g） 市售，產(chǎn)自云南楚雄；中性蛋白酶（15 萬 U/g）、堿性蛋白酶（15 萬 U/g）、風味蛋白酶（10 萬 U/g） 食品級，南寧龐博生物工程有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·） 梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基（）試劑盒、羥自由基（OH·）測定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒 南京建成科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙醇、四硼酸鈉、絲氨酸、抗壞血酸 國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛、二硫蘇糖醇 上海麥克林生化科技有限公司。

FDV 氣引式粉碎機 佑崎機械有限公司；BSA423S 電子天平 德國Sartorius 公司；Fe20-K多功能pH 計 瑞士Mettler Toledo 公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；TGL16M 高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DLSB-5-30 低溫冷卻循環(huán)泵 上海百典儀器設備有限公司；KQ3200DA 超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX3 漩渦混勻儀 德國KIA 公司；UV2600 紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美味牛肝菌的酶解工藝 美味牛肝菌粉碎，過60 目篩。稱取一定量美味牛肝菌粉，加入去離子水，調(diào)節(jié)pH，待混合液達到設定溫度后，加入適量酶進行酶解，酶解結束后于沸水浴條件下滅酶10 min。待酶解液冷卻至室溫后，離心（4 ℃，10000 r/min，15 min），取上層清液備用。

1.2.2 酶種類的篩選 稱取一定量美味牛肝菌粉樣品于燒瓶中，加入去離子水，在酶的推薦pH（中性蛋白酶7.0，堿性蛋白酶8.0，風味蛋白酶7.5）和推薦溫度50 ℃條件下進行酶解，初始酶解條件設置為加酶量5000 U/g，底物濃度5%，酶解時間90 min，酶解結束后沸水浴條件下滅酶10 min，離心，取上清液。以水解度、DPPH·清除率為評價指標，確定最佳蛋白酶種類。

1.2.3 單因素實驗 稱取一定量美味牛肝菌粉樣品于燒瓶中，加入去離子水，選取最佳蛋白酶，調(diào)節(jié)pH 至推薦值，在酶解時間90 min、加酶量5000 U/g、酶解溫度50 ℃的條件下研究底物濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%）對水解度和DPPH·清除率的影響；在加酶量5000 U/g、底物濃度5%、酶解溫度50 ℃條件下研究酶解時間（30、60、90、120、150、180 min）對水解度和DPPH·清除率的影響；在底物濃度5%、酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min 條件下研究加酶量（2000、3000、4000、5000、6000、7000 U/g）對水解度和DPPH·清除率的影響；在底物濃度5%、加酶量3000 U/g、酶解時間90 min 條件下研究酶解溫度（40、45、50、55、60、65 ℃）對水解度和DPPH·清除率的影響。

1.2.4 響應面試驗 根據(jù)Box-Behnken 中心組合實驗設計原理，運用Design-Expert V8.0.6.1 軟件，基于單因素實驗結果，采用4 因素3 水平的響應面分析法，以底物濃度（A）、酶解時間（B）、加酶量（C）、酶解溫度（D）為自變量，酶解液水解度（Y1）和DPPH·清除率（Y2）為響應值，各因素三個水平采用-1、0、1 進行編碼，因素水平和編碼見表1[18]。

表1 Box-Behnken 實驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.5 水解度的測定 水解度指蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵占總肽鍵的百分比，采用OPA 法進行測定[19]：酶解液樣品稀釋待測，取400 μL 待測液于5 mL 試管中，加入3 mL OPA 試液，混勻，靜置2 min，在340 nm 波長下測定吸光度。以絲氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=10.446x?0.0033，R2=0.9999。根據(jù)回歸方程和酶解液測得的吸光度計算樣品水解度，計算方法如式（1）、式（2）所示。

式中：WSerine-NH2表示每克蛋白質(zhì)所含絲氨酸氨基的量，mmol/g；htot表示每克蛋白質(zhì)所含的總肽鍵數(shù)，mmol/g；α，β分別用常數(shù)1.00、0.40 表示[20]。

1.2.6 DPPH·清除能力的測定 DPPH·清除能力的測定參照牛明福等[21]的方法進行調(diào)整：酶解液樣品稀釋待測，取2 mL 樣品液，加入0.01 mmol/L 的DPPH·溶液2 mL，混勻，室溫避光反應30 min，于517 nm 處測定吸光值A1；2 mL 無水乙醇和2 mL DPPH·溶液混勻，在517 nm 測定吸光值A2；取2 mL樣品溶液，加入2 mL 無水乙醇測其吸光度A3，計算酶解液樣品DPPH·清除率，計算方法如式（3）所示。

式中：C 表示DPPH·清除率，%；A1表示樣品液加DPPH·測得的吸光值；A2表示無水乙醇加DPPH·測得的吸光值；A3表示樣品液加無水乙醇測得的吸光值。

1.2.8 OH·清除能力的測定 采用OH·試劑盒測定，依據(jù)試劑盒說明書方法進行檢測獲得清除率。酶解液樣品稀釋待測，取0.2 mL 樣品液，反應液加入步驟按試劑盒說明進行，于550 nm 處測定吸光值（A1）；以去離子水代替樣品溶液重復上述操作，測定吸光值（A2），計算酶解液樣品OH·清除率，計算公式見式（5）：

式中：C 表示OH·清除率，%；A1表示樣品液加反應液測得的吸光值；A2表示以蒸餾水作為對照加反應液測得的吸光值。

1.2.9 總抗氧化能力的測定 采用總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒測定，依據(jù)試劑盒說明書方法進行檢測獲得總抗氧化活力單位。酶解液樣品稀釋待測，取0.1 mL 樣品液，反應液加入步驟按試劑盒說明進行，于520 nm 處測定樣品吸光值（A1）和對照吸光值（A2），計算樣品總抗氧化能力，計算公式見式（6）：

式中：C 表示總抗氧化能力單位，在37 ℃時，每分鐘每mL 酶解液樣品，使反應體系的吸光值每增加0.01 時，為一個總抗氧化能力單位；A1表示樣品液加反應液測得的吸光值；A2表示對照組吸光值；B1表示反應液總量；B2表示樣本取樣量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均重復3 次，數(shù)據(jù)結果以（平均值±標準差）標示。采用Design-Expert 8.0.6、Origin 2019 軟件設計和分析制圖，并進行二次回歸方程模擬和ANOVA 方差分析；P<0.05 為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酶種類的篩選

選擇中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶對美味牛肝菌進行酶解，反應初始條件設置為底物濃度5%，酶用量5000 U/g，酶解時間90 min，酶解pH 為各蛋白酶的最適條件。以酶解產(chǎn)物的水解度和DPPH·清除率為指標篩選水解美味牛肝菌的最佳蛋白酶，結果如圖1 所示。

圖1 蛋白酶種類對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.1 Effects of different protease on hydrolysis degree and DPPH·scavenging rate

蛋白酶具有專一性，不同蛋白酶對同一種蛋白的酶切位點不同，因此酶解產(chǎn)物的水解度也不盡相同[15]。由圖1 可知，三種蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度存在差異，中性蛋白酶的水解度最高（P<0.05），這可能與中性蛋白酶的內(nèi)切酶特性有關[22]。不同蛋白酶酶解產(chǎn)物含量和結構的差異導致其清除DPPH·的能力也有所區(qū)別。中性蛋白酶的DPPH·清除率最高，堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解產(chǎn)物的DPPH·清除率無顯著差異（P>0.05）。綜合考慮酶種類對水解度和DPPH·清除率的影響，選擇中性蛋白酶為最適酶進行后續(xù)酶解工藝的研究。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 底物濃度的確定 底物濃度對美味牛肝菌酶解產(chǎn)物DPPH·清除率和水解度的影響如圖2 所示。

圖2 底物濃度對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.2 Effects of substrate concentration on hydrolysis degree and DPPH·scavenging rate

由圖2 可知，底物濃度偏低時，水解度較低，這可能是在較低底物濃度下酶和底物的接觸幾率降低而造成的。隨著底物濃度增大，水解度升高，底物濃度為3%～5%時，酶解產(chǎn)物水解度隨底物濃度的增加無顯著性差異。底物濃度為6%時，底物濃度太高導致酶促反應體系過于粘稠，不利于酶與底物的有效結合，影響蛋白酶活力的釋放，酶解產(chǎn)物水解程度降低[23]。DPPH·清除率隨底物濃度的增加呈先增加后減小的變化趨勢，這可能是因為高濃度的肽導致功能部位受阻，并且由于相互作用導致抗氧化能力下降[24]。考慮到溶劑用量過多導致后續(xù)蒸發(fā)困難，從經(jīng)濟成本角度分析，綜合考慮底物濃度對水解度和DPPH·清除率的影響，選擇5%為最佳底物濃度。

2.2.2 酶解時間的確定 酶解時間對美味牛肝菌酶解產(chǎn)物DPPH·清除率和水解度的影響如圖3 所示。

圖3 酶解時間對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis time on hydrolysis degree and DPPH·scavenging rate

由圖3 可知，隨著酶解時間的延長，水解度逐步升高，但在90 min 以后上升趨勢不明顯，可能是90 min時酶與底物已充分結合。同時，產(chǎn)物的累積會抑制酶的活力，隨時間的延長，可酶解蛋白質(zhì)與產(chǎn)物的濃度差逐漸降低，導致水解度變化較小。DPPH·清除率隨時間變化的趨勢可以看出，酶解時間短時，自由基清除能力強，可能的原因是大分子的蛋白復合物也具有一定自由基清除作用[25]。隨著酶解時間的延長，DPPH·清除率呈先上升后下降的趨勢，這可能是由于水解度過小時，具有抗氧化活性的肽段不能完全暴露，抗氧化性弱；水解度過大時，抗氧化肽被進一步降解為游離氨基酸，活性較低不能發(fā)揮多肽穩(wěn)定自由基的作用[22]。為減少因酶解時間增加而帶來的能源浪費，綜合考慮酶解時間對水解度和DPPH·清除率的影響，選擇90 min 為最佳酶解時間。

2.2.3 加酶量的確定 加酶量對美味牛肝菌酶解產(chǎn)物DPPH·清除率和水解度的影響如圖4 所示。

圖4 加酶量對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.4 Effects of enzyme dosage on hydrolysis degree and DPPH·scavenging rate

由圖4 可知，隨著加酶量增加，水解度升高，原因可能是蛋白酶濃度的提高增大了與底物的接觸面積，加快了酶促反應速度從而使水解度上升[26]。通過組間比較，發(fā)現(xiàn)酶添加量為3000、4000、5000 U/g 時，水解度無顯著差異，這可能因為底物與酶的結合達到了飽和，不能再繼續(xù)反應。酶添加量進一步增加時，底物總量不變，體系在其他因素滿足的條件下，酶解液中的游離氨基態(tài)氮接近飽和，水解度變化減小。同時過高的酶添加量可能會造成蛋白酶自溶，從而使底物的水解度下降[24]。DPPH·清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在加酶量3000 U/g 時，清除率最高。加酶量高于3000 U/g，酶解液的抗氧化能力減小，這可能是加酶量增大，酶和底物接觸更充分，抗氧化成分被降解所致[15]。綜合考慮加酶量增加產(chǎn)生的經(jīng)濟成本，以及加酶量對水解度和DPPH·清除率的影響，選擇3000 U/g 為最優(yōu)加酶量。

2.2.4 酶解溫度的確定 酶解溫度對美味牛肝菌酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率和水解度的影響如圖5 所示。

酶解溫度對美味牛肝菌酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率和水解度的影響如圖5 所示。溫度對酶的催化反應有很大影響，酶的最高催化活性只能維持在一定的溫度范圍內(nèi)。由圖5 可知，隨著溫度升高，水解度和DPPH·清除率均呈先升高后降低的變化趨勢，溫度超過45 ℃時，水解度和DPPH·清除率降低。酶在最適溫度范圍內(nèi)，升高溫度有利于酶促反應的進行，水解度增大。當溫度高于最適溫度時，酶穩(wěn)定性降低，催化活性減弱，反應被抑制[27]。除影響酶解產(chǎn)物的水解程度以外，過高的溫度也有可能影響多肽的抗氧化活性。綜合考慮酶解溫度對水解度和DPPH·清除率的影響，選擇45 ℃為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度對水解度和DPPH·清除率的影響Fig.5 Effects of enzymolysis temperature on hydrolysis degree and DPPH·scavenging rate

2.3 響應面分析

2.3.1 響應面結果 為進一步研究變量之間交互作用的影響關系，使用響應面分析法篩選最佳酶解工藝。根據(jù)單因素實驗結果，基于Box-Behnken 采樣原理，選取底物濃度（A）、酶解時間（B）、加酶量（C）、酶解溫度（D）4 個因素為自變量，以酶解產(chǎn)物的酶解液水解度（Y1）和DPPH·清除率（Y2）為響應值，進行4 因素3 水平的響應面分析實驗。實驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface design and experimental results

運用Design-Expert 10.0.3 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析并進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

對回歸方程進行方差分析如表3 和表4 所示。從表3 可以看出，模型的決定系數(shù)R2為0.9653，說明模型具有較高顯著性，同時R2adj=0.9306，能夠解釋實驗93.06%的響應值變異，說明此實驗模型與真實數(shù)據(jù)擬合程度良好。工藝條件對水解度影響大小順序為：酶解時間>酶解溫度>底物濃度>加酶量。二次項中底物濃度和酶解時間對水解度的曲面效應極顯著（P<0.01），在相互作用中，AB、AD、BD 表現(xiàn)為極顯著（P<0.01）。由表4 可知，模型的決定系數(shù)R2為0.9593，模型具有高顯著性。工藝條件對DPPH·清除率的影響大小順序為底物濃度>酶解溫度>酶解時間>加酶量，二次項中酶解時間、加酶量和酶解溫度對DPPH·清除率的曲面效應極顯著（P<0.01），在相互作用中，AB、AD 表現(xiàn)為極顯著（P<0.01）。綜上所述，可以用該模型分析和預測美味牛肝菌蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度和DPPH·清除率，預測模型具有實踐指導意義。

表3 響應水解度擬合回歸方程的方差分析結果Table 3 Variance analysis for the fitted regression model of hydrolysis degree

表4 響應DPPH·清除率擬合回歸方程的方差分析結果Table 4 Variance analysis for the fitted regression model of DPPH·scavenging rate

2.3.2 響應面的交互作用分析 各因素之間交互作用對水解度的影響可通過圖6 所展示的響應面三維圖反映。響應面曲面坡度越陡峭，表示二者交互作用越顯著[28?29]。由圖6 可知，底物濃度-酶解時間、底物濃度-酶解溫度、酶解時間-酶解溫度交互作用對水解度的影響較為顯著。底物濃度-酶解時間交互作用中，酶解時間較底物濃度引起響應曲面更大幅度的波動，對水解度的影響更加顯著（圖6A）。圖6C 所示的底物濃度-酶解溫度交互作用引起響應曲面較大幅度變化，表明二者交互作用對水解度影響極顯著。由圖6E 可知，增加酶解時間同時降低酶解溫度有利于提高產(chǎn)物水解度。

不同工藝條件交互作用對DPPH·清除率的影響如圖7 所示。底物濃度-酶解時間交互作用對DPPH·清除率的影響結果表明，DPPH·清除率隨底物濃度的增加而增加，而酶解時間則引起自由基清除率先增加后降低的波動趨勢，其中底物濃度在交互作用中的貢獻更大（圖7A）。與圖7A 影響規(guī)律類似，圖7B 所示的底物濃度-加酶量交互作用對DPPH·清除率的影響表現(xiàn)為自由基清除率與底物濃度呈正相關關系，而加酶量過大或過小都不利于提高DPPH·清除率。圖7C 所示的底物濃度-酶解溫度交互作用引起響應曲面較大幅度變化，二者交互作用對DPPH·清除率影響極顯著。

圖6 各因素交互作用對水解度影響的響應面圖Fig.6 Surface response plot of the interaction of various factors on hydrolysis degree

圖7 各因素交互作用對DPPH·清除率影響的響應面圖Fig.7 Surface response plot of the interaction of various factors on DPPH·scavenging rate

2.3.3 最優(yōu)工藝條件實驗驗證 為協(xié)同考慮各因素之間的交互作用對水解度、DPPH·清除率的影響，進一步確定全局最優(yōu)解，根據(jù)Design-Expert 10.0.3 軟件運行結果，水解度和DPPH·清除率在底物濃度、酶解時間、加酶量、酶解溫度等因素共同影響下的最優(yōu)提取工藝為：底物濃度4%、酶解時間120 min、加酶量2423 U/g、酶解溫度40℃，在此條件下模型預測的水解度為36.56%，DPPH·清除率為54.39%。

根據(jù)模型預測結果，結合實際工藝設置的可行性，取底物濃度4%、酶解時間120 min、加酶量2500 U/g、酶解溫度40℃為條件進行三次重復實驗，得平均水解度為34.12%±0.68%、平均DPPH·清除率為55.91%±1.21%，與模型預測結果接近，表明基于該響應面模型分析優(yōu)化水解度和DPPH·清除率的酶解工藝有效可行。

2.4 美味牛肝菌酶解產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)研究

2.4.1 對DPPH·清除能力的測定 以抗壞血酸為對照，美味牛肝菌酶解產(chǎn)物清除DPPH·的結果如圖8所示。由圖8 可知，在一定濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物和抗壞血酸對DPPH·的清除率均隨濃度的增加而增強。酶解產(chǎn)物濃度超過一定范圍后，其自由基清除能力逐漸趨于平緩。根據(jù)線性回歸方程計算，美味牛肝菌酶解產(chǎn)物清除DPPH·的IC50值為0.88 mg/mL，抗壞血酸清除DPPH·的IC50值為3.63 μg/mL，酶解產(chǎn)物對于DPPH·的清除能力低于抗壞血酸的清除能力，但一般認為抗氧化劑清除DPPH·的IC50值低于10 mg/mL 時，即具有較好的抗氧化性[30]。

圖8 酶解液對DPPH·的清除能力Fig.8 DPPH·scavenging activity of enzymatic hydrolysate

圖9 酶解液對的清除能力Fig.9 scavenging activity of enzymatic hydrolysate

2.4.3 對OH·清除能力的測定 以抗壞血酸為對照，美味牛肝菌酶解產(chǎn)物清除OH·的結果如圖10 所示。由圖10 可知，在測定的酶解液濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加，OH·的清除率也逐漸增加，與抗壞血酸對OH·的清除趨勢一致。經(jīng)擬合曲線得到酶解液清除OH·的IC50值為0.24 mg/mL，抗壞血酸清除OH·的IC50值為0.37 mg/mL。由此可看出，在本實驗研究的酶解條件下得到的美味牛肝菌酶解液具有很好的OH·清除能力。

圖10 酶解液對OH·的清除能力Fig.10 OH· scavenging activity of enzymatic hydrolysate

2.4.4 總抗氧化能力的測定 以抗壞血酸為對照，美味牛肝菌酶解產(chǎn)物總抗氧化能力測定結果如圖11所示。由圖11 可知，在測定濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加，總抗氧化能力呈增加趨勢。在最優(yōu)酶解工藝條件下，制得的酶解液總抗氧化能力為18.82 U/mL，低于同濃度抗壞血酸溶液的抗氧化能力。

圖11 酶解液總抗氧化能力Fig.11 Total antioxidant capacity of enzymatic hydrolysate

3 結論

使用蛋白酶對美味牛肝菌進行酶解，以水解度和DPPH·清除率為評價指標，在單因素實驗基礎上進行響應面試驗，得出適宜美味牛肝菌水解的蛋白酶為中性蛋白酶，最佳酶解工藝條件為底物濃度4%，酶解時間120 min，加酶量2500 U/g，溫度40 ℃，此條件下所得美味牛肝菌蛋白水解度為34.12%，DPPH·清除率為55.91%。

酶解工藝可顯著提高美味牛肝菌的抗氧化能力。酶解產(chǎn)物清除DPPH·、OH·、三種自由基的IC50值分別為0.88、0.24、12.50 mg/mL，總抗氧化能力為18.82 U/mL，可用于功能食品的開發(fā)。研究僅對酶解液的抗氧化活性進行了初步探討，后續(xù)可進一步分離、純化和鑒定分子質(zhì)量不同的肽段，探究其結構及體內(nèi)體外抗氧化活性。