茶葉中赭曲霉毒素A 安全性風險研究進展

鄧秀娟，涂 青，伍賢學，黃剛驊，施宏媛，李亞莉，周紅杰,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南昆明 650201；3.玉溪師范學院化學生物與環(huán)境學院，云南玉溪 653100）

真菌毒素是某些真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的，具有細胞、器官或機體毒性的次生代謝產(chǎn)物。真菌毒素污染現(xiàn)象廣泛存在于各類食品中，嚴重威脅人類健康安全，已經(jīng)成為食品安全領(lǐng)域最重要的問題之一。目前已發(fā)現(xiàn)的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2 毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉素、桔青霉素等[1?2]。

茶葉是采用茶樹芽葉嫩莖經(jīng)過不同工藝加工而成的產(chǎn)品，是世界公認的三大健康飲料之一，也是僅次于飲用水的第二大消耗飲品。全球現(xiàn)有50 多個國家和地區(qū)種植茶樹，約有160 多個國家和地區(qū)人民有飲茶習慣，茶葉的品飲安全性對消費者健康以及茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展尤為重要。由于產(chǎn)毒真菌分布廣泛，茶園土壤和加工倉儲環(huán)境等環(huán)節(jié)都有可能存在真菌毒素污染風險。近年來，關(guān)于茶葉真菌毒素污染和品飲安全性的文章報道和話題討論屢見不鮮，引起了消費者的廣泛關(guān)注與諸多疑慮，如何客觀認識和科學對待這個問題十分關(guān)鍵。

赭曲霉毒素是一類由曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，最初發(fā)現(xiàn)由赭曲霉（A.ochraceus）代謝產(chǎn)生[3]。其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）產(chǎn)毒量最高，毒性最強，對農(nóng)作物污染最嚴重，健康危害最大，1993 年被國際癌癥機構(gòu)（IARC）認定為2B 類致癌物[4?5]。目前茶葉中黃曲霉毒素的研究相對較多，而赭曲霉毒素雖然在茶葉中也時有報道檢出[6]，但并未引起相關(guān)部門的足夠重視，這可能與其毒性級別比黃曲霉毒素低有關(guān)。然而，不同于黃曲霉毒素，赭曲霉毒素是可溶于水的，茶湯轉(zhuǎn)移率比黃曲霉毒素高，且其產(chǎn)毒菌曲霉屬和青霉屬均為茶葉加工和倉儲過程中的常見微生物，其潛在的安全性風險值得我們進一步關(guān)注和重視。

1 OTA 的特性與危害

1.1 OTA 的理化特性

赭曲霉毒素是一類具有香豆素和苯丙氨酸結(jié)構(gòu)的類似物的總稱，結(jié)構(gòu)通式見圖1A。依據(jù)結(jié)構(gòu)不同，赭曲霉毒素又分為A、B、α、β等類型，其中赭曲霉毒素A（OTA）的毒性最強[7?8]。OTA 是由OTα通過酰胺鍵與L-β-苯基丙氨酸相連絡(luò)合而成，其化學名稱為7-（L-β-苯基丙氨基-羰基）-羧基-5-氯代-8-羥基-3,4-二氫化-3R-甲基異氧雜奈鄰酮，分子式為C20H18ClNO6，分子量為403.8，化學結(jié)構(gòu)式見圖1B[9]。OTA 是一種無色結(jié)晶粉末狀化合物，呈弱酸性，微溶于水，易溶于極性有機溶劑和碳酸氫鈉溶液[10]。OTA 結(jié)構(gòu)中羥基基團以電離形式存在，是其發(fā)揮毒性所必需的條件，氯原子則在其遺傳毒性上發(fā)揮十分重要的作用，當OTA 的苯丙氨酸基團被其他氨基酸取代時其毒性將會被降低[11]。然而，OTA 性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，不易降解，食品一旦受到OTA 污染，要想完全去除十分困難。

圖1 赭曲霉素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of ochratoxin

1.2 OTA 的危害與致毒機理

OTA 在自然界廣泛存在，食物中即使沒有肉眼可見的霉菌，也可能已有OTA 的存在[12]。20 世紀70 年代至今，OTA 已陸續(xù)在谷物、茶葉、面粉、咖啡、巧克力、蔬菜、果汁、葡萄酒等中被廣泛檢測出來，甚至嬰幼兒輔食、人類母乳也發(fā)現(xiàn)了OTA[13?17]。OTA 經(jīng)由胃腸道吸收后，經(jīng)由血液主要流到腎臟，由于其在人或動物體內(nèi)不易代謝消除，易在血液及消化組織器官中累積，并可引發(fā)亞急性或慢性毒性影響[18]。流行病學研究普遍認為OTA 的體內(nèi)積累和對腎臟的損傷是巴爾干地方性腎病的主要原因，還會對胎兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害[19?20]。大量科學研究也表明OTA 具有腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、植物毒性、基因毒性和潛在的致畸性和致癌性等[21?22]。

OTA 能促進生物膜的過氧化反應(yīng)，誘導活性氧的產(chǎn)生，引起線粒體的結(jié)構(gòu)損傷及功能的紊亂，抑制其呼吸作用，誘導細胞凋亡；能夠影響細胞信號傳導通路中蛋白及關(guān)鍵因子的轉(zhuǎn)錄表達，在很大程度上抑制蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶的活性，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而影響RNA 和DNA 的合成[23]。研究者推測這些改變及其產(chǎn)生的一系列后續(xù)反應(yīng)都有可能是OTA致毒的原因。世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會(JECFA)經(jīng)過對OTA 腎臟毒性的評價后，建議每周OTA 最大耐受攝入量為0.1 μg(每千克體重)[24]。目前，歐盟、中國、丹麥、羅馬尼亞、意大利等相關(guān)機構(gòu)分別針對成人食用生谷物及其制品、干鮮果品、谷物豆類及其制品、堅果、研磨咖啡、酒類、豬肉及熟肉制品等進行了OTA 限量標準[25?28]，但茶葉中的OTA 暴露風險及限量標準仍然尚未被提及。

2 茶葉中的OTA 來源微生物

2.1 OTA 的產(chǎn)毒菌與產(chǎn)毒條件

自然界中能產(chǎn)OTA 的真菌種類繁多，主要有曲霉屬的赭曲霉（A.ochraceus）、炭黑曲霉（A.cabonarius）、黑曲霉（A.niger）和青霉屬的疣孢青霉（P.verrucosum）、日耳曼青霉（P.nordicum）、鮮綠青霉（P.viridicatum）等。其中A.niger只有一部分菌株可產(chǎn)OTA[29?30]。此外，曲霉屬中韋斯特迪克氏曲霉（A.westerdijkiae）、洋蔥曲霉（A.alliaceus）、硫色曲霉（A.sulphureus）、蜂蜜曲霉（A.melleu）、佩特曲霉（A.petrakii）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）、煙曲霉（A.fumigatus）、雜色曲霉（A.versicolor）、塔賓曲霉（A.tubingensis）等在特定情況下會產(chǎn)較高量的OTA[31?33]，青霉屬其他一些菌株如變幻青霉（P.variabile）、園弧青霉（P.cyclopium）、產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）、波蘭青霉（P.polonicum）等也可以產(chǎn)生少量OTA[34]。OTA 主要產(chǎn)毒菌見表1。值得注意的是，產(chǎn)毒菌中并非所有菌株都能產(chǎn)OTA，不同地域和生態(tài)環(huán)境條件下，OTA 毒素爆發(fā)率及產(chǎn)毒菌的種類也不同。研究發(fā)現(xiàn)在溫和涼爽的環(huán)境條件下，青霉屬菌株是主要的OTA 產(chǎn)毒菌，貯藏環(huán)境中污染風險較高;而在溫度高、濕度大的環(huán)境條件下，產(chǎn)OTA 的菌株則主要為曲霉屬中的赭曲霉和炭黑曲霉[35]。

表1 OTA 主要產(chǎn)毒菌Table 1 Major fungi producing OTA

影響農(nóng)產(chǎn)品中OTA 污染程度的主要因素包括生產(chǎn)環(huán)境、干燥條件及貯藏方式，溫度、水活度和基質(zhì)成分等會影響產(chǎn)毒菌的生理機能及產(chǎn)毒效率。目前關(guān)于OAT 主要產(chǎn)毒菌的適宜生長和產(chǎn)毒條件研究情況見表2。赭曲霉在pH 低于2 時生長較緩慢[28]，高于30 ℃時赭曲霉菌的生長和OTA 的產(chǎn)生停滯，低溫保藏（2～10 ℃）可減緩但不能停止OTA 的產(chǎn)生，而干燥保藏（濕度<14%）是防止OTA 產(chǎn)生積累的有效方法[24,29,36]。炭黑曲霉是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種能夠產(chǎn)生OTA 的真菌，由于其形態(tài)與黑曲霉相似，食品真菌菌相污染水平調(diào)查和分離鑒定時常誤將其歸為黑曲霉。該菌繁殖所需的溫度范圍較寬，低pH、高糖、高溫環(huán)境促進炭黑曲霉的生長繁殖。低溫抑制黑曲霉的繁殖但炭黑曲霉生長良好，且40 ℃時仍可繁殖，同時該菌對紫外線有較強的抵抗力[37]。

表2 OTA 主要產(chǎn)毒菌的適宜生長及產(chǎn)毒條件[28,35-39]Table 2 Suitable growth and toxigenic conditions of main toxigenic fungi of OTA[29,36-40]

2.2 茶葉中可能產(chǎn)OTA 的微生物

OTA 產(chǎn)毒真菌分布廣泛，從茶園、生產(chǎn)車間到倉儲流通環(huán)節(jié)，茶葉都存在受到產(chǎn)毒真菌污染的可能。尤其是黑茶，由于追求后期倉儲過程中的轉(zhuǎn)化，通常選取的是非密閉型包裝材質(zhì)和自然存放空間，使得茶葉可與空氣接觸進行后發(fā)酵陳化。因此茶葉所處的溫濕度條件差異較大，大部分取決于存放地的自然氣候生態(tài)，這種情況導致茶葉中經(jīng)常會有青霉或曲霉的存在，甚至在梅雨季節(jié)和回潮天氣發(fā)生霉變，加大真菌污染風險。而在黑茶加工過程中，渥堆發(fā)酵是其風味品質(zhì)形成的關(guān)鍵。發(fā)酵過程中，各種微生物以茶葉基質(zhì)為營養(yǎng)源，呼吸產(chǎn)熱，并大量繁殖和代謝，分泌各種胞內(nèi)酶和胞外酶，催化茶葉發(fā)生氧化、分解、裂解、聚合、縮合等一些列復雜的生化反應(yīng)，從而形成黑茶特有的色香味。現(xiàn)代大量科學研究結(jié)果表明，曲霉屬、青霉屬、酵母屬等是黑茶發(fā)酵過程中微生物群落主要的組成部分，其中曲霉屬中的炭黑曲霉、黑曲霉、煙曲霉、土曲霉、塔賓曲霉等經(jīng)常在加工過程中被檢出，而青霉屬中的產(chǎn)黃青霉和曲霉屬中的赭曲霉則有在倉儲過程中被檢出。茶葉生產(chǎn)倉儲環(huán)節(jié)中可能產(chǎn)OTA 的微生物檢測情況見表3。

表3 茶葉生產(chǎn)倉儲環(huán)節(jié)中可能產(chǎn)OTA 的微生物檢測情況Table 3 Microorganisms that are likely to produce OTA in tea processing and storage

結(jié)合OTA 的產(chǎn)毒菌和產(chǎn)毒條件可以發(fā)現(xiàn)，其與茶葉發(fā)酵和倉儲過程中的溫濕度條件等存在一定程度上的重合。OTA 的兩大類產(chǎn)毒菌中，青霉屬真菌恰恰是茶葉尤其是黑茶在倉儲存放過程中經(jīng)常會出現(xiàn)的真菌，而曲霉屬真菌則又是黑茶發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌屬，和黑茶的關(guān)鍵品質(zhì)形成關(guān)系密切，其對品質(zhì)形成的貢獻度與可能帶來的安全風險值需要我們開展進一步的研究評估。如何通過有效措施規(guī)避風險，安全生產(chǎn)和倉儲，保障茶葉品飲安全，也是我們需要重點關(guān)注的問題。

3 茶葉中的OTA 檢測

目前已有不少研究學者采用各種技術(shù)手段對茶葉中的OTA 進行了檢測[6,65?66]。1995～1998 年歐盟國家檢測了139 份紅茶樣品，其中8 份樣品OTA 陽性，含量為0.03～10.3 μg·kg?1[67]。Santos 等[68]應(yīng)用ELISA 法檢測了西班牙包括市售紅茶、綠茶和白茶等在內(nèi)的84 個樣品中的OTA，發(fā)現(xiàn)63%受到OTA污染（0.025～17.5μg·kg?1）。柳其芳[69]應(yīng)用ELISA 法檢測普洱茶樣品也檢出了赭曲霉毒素。但由于茶葉基質(zhì)的復雜性等，酶聯(lián)免疫法存在假陽性干擾，導致很多人認為其更適用于初步快速篩查。

隨著食品中OTA 檢測技術(shù)的發(fā)展，HPLC 和LC-MS 等開始被廣泛應(yīng)用。Haas 等[48]采用HPLC法檢測了36 份普洱茶樣品，其中4 份樣品OTA 陽性，含量為0.65～94.7 μg·kg?1。劉妍等[70]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)從61 份黑茶樣品中檢出5 份含有赭曲霉毒素，其中普洱茶2 份（6.7、2.5μg·kg?1），湖南黑茶1 份（4.0 μg·kg?1）、廣西六堡茶2 份（0.9、1.3 μg·kg?1）。與之不同的是，陳秋娥[71]分析了44 件臺灣市售普洱茶樣品，未檢測到OTA。Monbaliu等[72]建立了一個可同時測定含OTA 在內(nèi)27 種真菌毒素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測了91 份茶葉樣品，結(jié)果都沒有檢測到有OTA。莫瑾等[73]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測了19 份普洱茶樣品，結(jié)果也均未檢出OTA。Mogensen 等[74]采用HPLC 法檢測的市售的普洱茶和紅茶樣本，結(jié)果亦未檢出OTA。

為了進一步探究普洱茶發(fā)酵過程中的微生物安全性，周才碧[62?63]利用普洱茶中分離、鑒定得到的黑曲霉和赭曲霉，接種于云南大葉種中模擬發(fā)酵，采用HPLC 法檢測出發(fā)酵樣中的OTA 含量分別為3.80 和1.80 μg·kg?1。然而，Abe 等[50]應(yīng)用HPLC 檢測結(jié)果顯示，從普洱茶中分離的黑曲霉不產(chǎn)生OTA。Hou 等[75]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用黑曲霉和炭黑曲霉發(fā)酵的茶葉樣品中也不含OTA。Wang 等[76]采用LC-MS/MS 法檢測發(fā)現(xiàn)，采用塔賓曲霉接種發(fā)酵的普洱茶和傳統(tǒng)自然發(fā)酵的普洱茶樣品中OTA 也均低于檢測限。

此外，由于OTA 的水溶性特征，部分研究者在檢測茶葉中OTA 含量的同時，還進行了茶湯轉(zhuǎn)移率的實驗。Sofie Monbaliu 等研究顯示其檢測茶葉樣品中的赭曲霉素含量范圍為2～10 μg·kg?1，沖泡后的茶湯中的含量范圍為0.5～2 ng·mL?1。Frantisek[77]采用HPLC-FLD 方法對共計12 份紅茶樣品進行了OTA 含量的分析，其中有4 個樣本檢出OTA，含量分別為1.85、56.7、86.6 和250 μg·kg?1，將受污染的茶樣在250 mL 水中煮3 min 后茶湯中OTA 的轉(zhuǎn)移率達到34.8%±1.3%。

從以上研究中可以發(fā)現(xiàn)，茶葉中的OTA 檢測研究目前多集中在黑茶類，白茶、綠茶和紅茶也有少量的涉及。由于樣品及測定方法不同，茶葉中的OTA 檢測結(jié)果并不一致。相對而言，ELISA 法檢測結(jié)果中呈OTA 陽性的情況居多，LC-MS/MS 法檢測結(jié)果中呈陰性的情況居多，但仍有陽性情況存在。此外，這些研究資料中大多沒有表明其檢測樣品的具體來源和倉儲狀態(tài)等情況，茶葉樣品前處理方法也并不清楚，這為科學評估茶葉中的OTA 安全性風險帶來了一定困難。茶葉中OTA 的檢測情況見表4。

表4 茶葉中的OTA 檢測情況Table 4 Detection of OTA in tea

4 茶葉中的OTA 潛在風險分析與建議

4.1 樣品前處理方法和分析手段干擾茶葉中OTA 檢測的準確性

由于OTA 產(chǎn)毒菌的多樣性和分布廣泛性，科研工作者們圍繞食品中OTA 的檢測方法、樣品前處理方法、產(chǎn)毒條件、致毒機理和抗毒脫毒方法等開展了大量研究。目前，OTA 的檢測方法主要有薄層層析法、高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳-二極管陣列檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、時間分辨熒光免疫分析法、膠體金免疫層析法、化學發(fā)光酶免疫分析法、免疫傳感器檢測法、免疫親和柱層析凈化-熒光光度法以及基于適配體的快速檢測方法等[78?83]。其中酶聯(lián)免疫法雖然早期應(yīng)用較多，但由于存在假陽性干擾等問題，更適于初步快速篩查，通常不作為污染評估依據(jù)。而液相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)果可靠度相對較高，是目前比較主流的檢測手段。由于茶葉基質(zhì)的復雜性，樣品前處理的方法選擇會直接影響到茶葉OTA 檢測結(jié)果的準確性和可重現(xiàn)性。而目前茶葉中的OTA 研究仍主要集中于茶葉成品的OTA 檢測和安全性評估，尚未見單獨針對茶葉中OTA 分離純化和檢測分析方法的研究，這給茶葉中OTA 的暴風險評估帶來了極大的不確定性。此外，由于已有研究中，被測樣品的來源和加工條件倉儲狀態(tài)等信息不明，正常生產(chǎn)倉儲的茶葉到底有沒有可能存在OTA，哪些情況會加大OTA 在茶葉中的污染風險，也還有待進一步研究評估。因此，后續(xù)研究中，應(yīng)加大關(guān)于樣品來源的監(jiān)管和設(shè)計，重視茶葉中OTA 的前處理方法和分析手段研究，提高相關(guān)實驗設(shè)計和技術(shù)手段的水平，增強研究結(jié)果的準確性和可靠性，為茶葉中的OTA 風險評估提供科學依據(jù)和有力支撐。

4.2 應(yīng)客觀認識微生物這把雙刃劍，加強茶葉生產(chǎn)倉儲中的真菌毒素風險控制

隨著茶業(yè)的發(fā)展，茶葉的各種養(yǎng)生保健功效逐漸被人們所熟知，但其潛在的微生物安全風險尚未引起足夠重視。哪怕是微生物參與度很高的黑茶，人們大都關(guān)注其有益微生物對品質(zhì)形成的有利面，往往忽視了其可能潛在的毒害風險?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示茶葉中存在較多可能產(chǎn)OTA 的真菌，且生產(chǎn)加工和貯藏過程中的溫濕度與OTA 產(chǎn)毒菌的適宜生長和產(chǎn)毒條件存在一定程度的重合，有可能會誘發(fā)真菌產(chǎn)毒。而OTA 檢測結(jié)果也顯示茶葉中存在一定的OTA 污染風險。

另一方面，已有大量文獻研究表明[84?86]，綠茶、紅茶、黑茶、普洱茶等都具有解毒作用，可能抑制產(chǎn)毒真菌的生長或產(chǎn)毒并降低真菌毒素的毒性；且酵母、曲霉、根霉、乳桿菌、芽孢桿菌、短桿菌等對OTA 具有脫毒作用（包括吸附、轉(zhuǎn)化和降解等可能途徑）。這也預示著，在茶葉加工過程中的有益微生物和某些活性成分有可能對OTA 有一定的抑制作用，這也值得我們后期進一步開展相關(guān)研究。

因此，應(yīng)加強茶葉加工和倉儲過程中的微生物污染風險控制，開展茶葉特別是黑茶中OTA 污染情況及檢測方法研究，科學評估茶葉中OTA 對人體健康的潛在風險，制定相應(yīng)毒素限量標準；發(fā)展快速、靈敏、簡便的檢測篩選OTA 產(chǎn)生菌的方法進而建立生物防治體系，并對OTA 的生物學作用及其作用機制做更深入的研究，精確解析有害微生物的產(chǎn)生條件和有毒菌株的產(chǎn)毒可能性，進一步確立在茶葉加工、倉儲環(huán)節(jié)中抑制OTA 產(chǎn)生菌株的生長繁殖的方法，從源頭上解決OTA 的污染問題。

5 總結(jié)與展望

茶葉存儲過程中，因干燥包裝或存放條件不當引起茶葉吸濕受潮都可能造成真菌污染；而黑茶等微生物發(fā)酵茶葉在渥堆發(fā)酵過程中，由于多種類型真菌的參與，更是容易增加真菌毒素污染的風險?；贠TA 產(chǎn)毒菌種類眾多，適宜和產(chǎn)毒條件與黑茶倉儲和發(fā)酵過程中的條件有較大程度的重合，且OTA 可水溶轉(zhuǎn)移到茶湯，不易降解，因此其在茶葉中的安全性風險值得引起我們的關(guān)注和重視。然而值得注意的是，由于目前對茶葉中OTA 的檢測方法和樣品前處理方法的研究不夠，且現(xiàn)有文獻中有一大部分沒有寫明其樣品來源和具體的樣品前處理方法，不排除存在假陽性情況的可能，不足以為茶葉中OTA 的安全性風險評估提供堅實可靠的依據(jù)，因此還有待進一步的研究確證。另外，由于茶葉基質(zhì)和微生物互作等復雜性，茶葉加工過程中的有益微生物和某些活性成分可能對OTA 有一定的抑制作用，這也值得我們后期進一步開展相關(guān)研究。因此，茶葉中潛在的OTA 污染風險，值得引起重視，但也不宜過分夸大，關(guān)鍵在于監(jiān)測方法和防控措施的跟進，從而有效保障茶葉的規(guī)范化生產(chǎn)和安全化品飲。