國產(chǎn)谷胱甘肽還原酶試劑盒分析性能驗證與評價

況凌云，桂曉美，徐連強

（江西省人民醫(yī)院檢驗科，江西 南昌30006）

還原型谷胱甘肽（GSH）是細胞內(nèi)清除活性氧(ROS)的一種抗氧化物[1],谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)通過氧化GSH為氧化型谷胱甘肽（GSSG）有利于清除過氧化物。而谷胱甘肽還原酶（GR）作為另一種細胞內(nèi)還原酶,它能還原GSSG成GSH,維持GS H/GSSG的比值[2]，而GSH/GSSG比值被認為是抗氧化能力的靈敏參數(shù)[3]。因而，GR在機體清除氧化損傷上起到至關重要的作用。近年來學者對GR的關注逐漸增多，GR檢測逐步推廣于臨床應用。據(jù)相關研究報道，GR有利于增強宿主抵抗細菌感染的能力，并且血漿GR的活性與膿毒癥休克的預后密切相關[4,5]；在肺損傷、腎移植、肝臟損傷以及慢性乙型病毒肝炎中的患者中，GR的濃度也都有相關性的變化[6-9]。本實驗室在日立7600-120全自動生化分析儀上測試GR，為保證結(jié)果的可靠性，此研究對目前中拓生物有限公司生產(chǎn)的GR測定試劑盒進行詳細的分析性能驗證，報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2018年10月份在江西省人民醫(yī)院就診患者的新鮮血清標本,健康人群組選取本院同一時期體檢中心健康人群者20例，男女各占一半，年齡覆蓋各年齡層。上述所有標本均無溶血、無黃疸、無脂濁，且2h內(nèi)無法進行檢測的血清標本均于-20℃凍存處理。

1.2 儀器與試劑⑴儀器：儀器為HITACHI 7600-120全自動生化分析儀；⑵試劑：谷胱甘肽還原酶試劑為中拓生物有限公司制造,實驗過程中使用原廠配套的校準品和質(zhì)控品。干擾試驗所用干擾物為寧波瑞源生物科技有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 精密度評價 根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinicaland LaboratoryStandards Institute,CLSI)EP15-A2方案來驗證其精密度。配制高、低濃度兩個水平的混合血清，分裝并-20℃凍存。每天分別重復測試2個水平濃度血清標本4次,連續(xù)檢測5天,計算批內(nèi)CV（%）和總CV（%），并確認其不精密度范圍是否小于廠商提供的精密度。

1.3.2 正確度試驗 根據(jù)CLSI EP9-A2方案評價其正確度。該方案包含兩種程序來核實其正確度：一是用病人樣本進行方法學比對；二是通過檢測定值的參考物來計算回收率。由于本區(qū)域缺乏其他對照方法,故需通過檢測廠家提供的定值質(zhì)控物計算其回收率或者偏差來驗證其正確度,且每個樣品重復測定3次。正確度要求:偏差不應該超過10%。

1.3.3 線性范圍評價 操作參考CLSI EP6-A方案要點,并通過改良Doumas法分析其線性范圍數(shù)據(jù)。具體要求如下:選擇接近預期線性范圍上限和下限的兩個分析濃度的病人血清標本,分別作為實驗所需的高值樣本（H）和低值樣本（L）。按照1L、0.8L＋0.2 H、0.6L＋0.4H、0.4L＋0.6H、0.2L＋0.8 H、1H配制方法，制成6個不同濃度的系列評價樣本，在生化分析儀上重復測定2次，在一個分析批內(nèi)完成。樣本的預期值為X，樣本的兩次測定值的均值為Y，得回歸方程Y=b0+b1X。

判定結(jié)果：若相關系數(shù)R2>0.95，說明預期值與測量值之間相關性極好；當b1很接近1(一般以b1在1±0.03 范圍內(nèi))，b0接近于0(若b0不接近0，需滿足截距b0與0差異的t檢驗呈無顯著性差異)，則可判斷該測定方法在所涉及的濃度范圍內(nèi)呈線性。

1.3.4 臨床可報告范圍 收集接近預期線性范圍上限的病人血清標本,用純水分別進行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍濃度的稀釋處理,每個濃度重復2次測定。以未稀釋樣本的結(jié)果作為預期值，樣本稀釋后測定結(jié)果為實測值,計算各稀釋度下的測量回收率?；厥章试?0%~110%范圍內(nèi)，該稀釋倍數(shù)是可靠的。臨床可報告范圍=線性范圍×最大稀釋倍數(shù)。

1.3.5 生物參考區(qū)間驗證 參照CLSI SC28-A3文件，收集20例健康體檢者血清，男女各10例，覆蓋各年齡層。在生化分析儀上進行測定,確保20例測試結(jié)果不含離群值。

結(jié)果判定：如果20個測試結(jié)果中不超過2例在驗證的參考區(qū)間之外，此參考區(qū)間可以接受。如果3例或以上樣本超出界限，則需重新選擇20例參考個體進行驗證,若再次測試后不超過2例超過參考限，則該參考區(qū)間可以接受。若仍有3個或以上的觀測值超出區(qū)間,則應分析原因并且考慮是否自建參考區(qū)間。

1.3.6 抗干擾能力測試 參照CLSI EP7-A2文件進行抗干擾驗證試驗,選取參考區(qū)間范圍內(nèi)患者血清標本作為測試樣本，干擾物選取游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白，并分別配制濃縮20倍的各干擾物貯存液。各干擾物和測試樣本按照1：19的比例配制高濃度干擾物測試樣，同時用蒸餾水作為對照,按同樣比例配制低濃度干擾物測試樣。以高濃度干擾物測試樣本和低濃度干擾物測試樣本按一定比例混合一系列濃度,即75%濃度樣本，50%濃度樣本和25%濃度樣本。每個干擾物各濃度樣本測試3次,取平均值，計算其相對偏倚，偏倚超過10%考慮該濃度干擾物存在干擾現(xiàn)象。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用MicrosoftExcel2003和SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學分析。進行簡單的線性回歸分析和相關性判斷,對截距進行差異t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證結(jié)果 由于GR是比較新穎的臨床檢驗項目,所以美國臨床實驗室修正法規(guī)(1988)(Clinical Laboratory Improvement Amendment 88，CLIA’88)以及衛(wèi)生部臨床檢驗中心(CLSI)室間質(zhì)量評價(EQA)均無該項目的評價標準。因此該項目的參照標準暫時只能與廠家聲明進行比對。表1和表2結(jié)果顯示,在兩個濃度水平下,GR的批內(nèi)C V值和總CV值都遠低于廠家聲明(CV≤10%)。由此可見,該國產(chǎn)GR試劑盒的精密度性能驗證合格。

表1 低濃度水平GR精密度驗證結(jié)果

表2 高濃度水平GR精密度驗證結(jié)果

2.2 正確度驗證結(jié)果 在精密度滿足廠家申明后，參照CLSI EP9-A2方案要求,通過檢測廠家提供的定值質(zhì)控品來驗證GR的正確度，表3結(jié)果顯示，該國產(chǎn)GR試劑檢測定值質(zhì)控物靶值的相對偏差為-2.38%，遠小于廠家申明的10%。因此，該試劑通過正確度驗證。

2.3 線性范圍的評價 采用了改良Doumas法分析表4的線性范圍驗證的數(shù)據(jù),可得到圖1中Y=1.0078X+3.9815的線性方程,其中R2=0.9983>0.95，斜率b1=1.0078，在1±0.03范圍內(nèi)，雖然截距b0不接近0，但作截距與0差異的t檢驗，t值為1.126

表3 GR正確度驗證結(jié)果

表4 GR線性范圍驗證數(shù)據(jù)結(jié)果

圖1 GR檢測線性回歸方程曲線

2.4 臨床可報告范圍 以GR濃度接近最高線性范圍為測試樣品，用廠家推薦的稀釋液（純水）進行2、4、8、16、32、64倍稀釋，每個濃度重復測定2次，以樣品未稀釋的結(jié)果作為預期值,各稀釋度下測得結(jié)果為檢測值,并計算各稀釋度的回收率,應在90%~110%范圍內(nèi)。表5數(shù)據(jù)可見，該國產(chǎn)GR試劑的最大稀釋倍數(shù)為4,故其臨床可報告范圍為4~1200 U/L。

2.6 生物參考區(qū)間驗證 廠家申明提供GR的生物參考區(qū)間為33~73 U/L,如表6所示,20例健康體檢者的GR檢測結(jié)果最高值為74.6 U/L,最低值為54.2U/L，離群值檢測結(jié)果為陰性，并且僅有一例檢測結(jié)果超出廠家提供的生物參考區(qū)間，故該GR試劑參考區(qū)間驗證通過。

表5 國產(chǎn)GR試劑臨床可報告范圍試驗

表6 國產(chǎn)GR試劑生物參考區(qū)間驗證

2.7 抗干擾能力 依據(jù)CLSI EP7-A2文件，將不同濃度的游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白和待測血清按1:19的比例混合,各混合樣本分別測定3次取均值，計算其干擾偏差；要求干擾偏差在±10%范圍內(nèi)。由表7結(jié)果可見,游離膽紅素≤20mg/dL、結(jié)合膽紅素≤20mg/dL、甘油三酯≤20mmol/L、血紅蛋白≤50mg/dL時，該國產(chǎn)GR試劑檢測結(jié)果偏差均在±10%以內(nèi),但抗干擾能力存在一定差異。

3 討論

2018版CNAS-CL02-A003文件規(guī)定，實驗室使用非配套分析系統(tǒng)之前,應有相應程序評估并確認正確度、精密度、可報告范圍、生物參考區(qū)間等分析性能符合預期用途。為了保證檢測結(jié)果的高質(zhì)量，穩(wěn)定和有效的檢測系統(tǒng)是必備的前提。參照CLSI EP15-A2方案進行精密度驗證,選取接近醫(yī)學決定水平處的高、低雙濃度水平進行實驗。本實驗GR兩個濃度對應的批內(nèi)精密度CV值為0.34%~1.65%、0.41%~1.38%,以及批總精密度CV值為2.32%、0.76%，均遠低于廠家申明<10%的要求。精密度驗證試驗應放在其他性能驗證試驗之前，否則無法保證后續(xù)性能驗證結(jié)果的可靠性[10]。正確度為大批檢測結(jié)果的均值與真值的一致程度,通常用與正確度相反的統(tǒng)計量“偏倚”來表示。本驗證試驗依據(jù)CLSI EP9-A2方案,通過檢測定值的參考物來計算回收率以評價其正確度。該GR試劑驗證相對偏差為-2.38%，小于廠家申明的10%。由此可見，該GR檢測系統(tǒng)正確度良好。線性范圍又稱分析測量范圍，是指樣本未經(jīng)任何處理（稀釋、濃縮或其他預處理），由檢測系統(tǒng)直接測量得到的可靠結(jié)果范圍,在此范圍內(nèi)一系列不同樣本分析物的測量值與其實際濃度（真值）呈線性比例關系。而臨床可報告范圍是指患者標本經(jīng)稀釋、濃縮或其他處理后，向臨床所能報告的結(jié)果范圍[11]。參照CLSI EP6-A文件和改良Doumas法，本次實驗得出線性方程為Y=1.0078X+3.9815，其中R2=0.9983>0.95，斜率b1=1.0078在1±0.03范圍內(nèi)，截距b0與0做t檢驗,結(jié)果顯示無顯著性差異。故其線性范圍在4.9~277.4U/L內(nèi)良好,符合廠家申明的線性范圍4~300U/L，且最大稀釋倍數(shù)為4，臨床可報告范圍為4~1200U/L。確定本檢測系統(tǒng)精密度和正確度符合實驗室要求后,仍需驗證廠商提供的生物參考區(qū)間。按照CLSI SC28-A3文件的要求，檢測20例健康體檢標本，確保20例測試結(jié)果不含離群值。通過測試計算，95%測試結(jié)果均在廠家聲明的參考區(qū)間33~73U/L以內(nèi)，即該試劑的生物參考區(qū)間驗證符合廠家要求。為了進一步了解黃疸、脂濁、溶血是否影響GR的檢測結(jié)果,故選取游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白等干擾物,參照CLSI EP7-A2文件驗證其抗干擾能力。干擾實驗結(jié)果表明，當游離膽紅素≤20mg/dL、結(jié)合膽紅素≤20mg/dL、甘油三酯≤20mmol/L、血紅蛋白≤50mg/dL，對試劑檢測無明顯干擾。故該GR試劑對黃疸和脂濁耐受性良好，溶血會產(chǎn)生一定程度的正偏離。

表7 不同濃度干擾物對GR檢測結(jié)果產(chǎn)生的偏差

綜上所述，此次研究對該國產(chǎn)GR試劑盒檢測的精密度、正確度、線性范圍、臨床可報告范圍、生物參考區(qū)間、抗干擾能力等性能驗證的結(jié)果良好，各性能指標均符合廠家申明以及CLSI相關文件的要求，保證了測試結(jié)果的準確、可靠，可應用于臨床分析研究。