3個(gè)基因共調(diào)控下萊茵衣藻的轉(zhuǎn)錄組分析

黃 瑛，李小連，殷劍波，林永祺，彭小波，賈 彬

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋藻類生物工程技術(shù)研究中心，廣東深圳518060

三酰甘油(triacylglycerol, TAG)是自然界中脂肪的主要成分，其基本組成單位為脂肪酸(fatty acid, FA)，是生物柴油、食用油等油制品的組成成分．TAG的生物合成通路包括脂肪酸的合成途徑及肯尼迪途徑(Kennedy pathway)[1]．同時(shí)，TAG和FA的分解代謝產(chǎn)物也為脂肪的合成提供乙酰輔酶A．此外，脂肪代謝還與糖類和蛋白質(zhì)的代謝通過乙酰輔酶A、丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物建立了緊密的聯(lián)系，形成復(fù)雜的碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)．目前，單基因調(diào)控下提高工程藻株脂肪積累的研究已取得一定的進(jìn)展，長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)參與FA的合成、活化與β-氧化，沉默cracs2基因后萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)的TAG質(zhì)量較野生型提高了55%[2].在三羧酸循環(huán)中，草酰乙酸和乙酰輔酶A在檸檬酸合酶(citrate synthase, CIS)的作用下形成檸檬酸，是關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)反應(yīng)．有研究表明，cis的沉默使得萊茵衣藻的TAG增加了169.5%[3].DOF(deoxyribonucleic acid binding with one finger)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)植物的種子萌發(fā)和碳氮代謝等代謝過程，在萊茵衣藻中過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子后，胞內(nèi)總脂肪酸的含量為126.01 μg/mg，提高了23.24%[4]．但關(guān)于構(gòu)建多基因工程藻株以提高脂肪含量的報(bào)道較少，且對(duì)于碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)中的脂肪合成調(diào)控機(jī)制有待深入研究．

萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii,C.reinhartii)為光合微藻中的模式生物，具有光合效率高、繁殖速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，適合于構(gòu)建高產(chǎn)脂質(zhì)的工程藻株．轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效手段[5-6]，萊茵衣藻的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，且缺乏與調(diào)控機(jī)制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組信息，這有礙于相關(guān)基因的功能挖掘．本研究對(duì)3基因共調(diào)控下的萊茵衣藻藻株DLC(沉默acs2和cis1基因，且過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)分析，進(jìn)一步揭示多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下萊茵衣藻脂質(zhì)合成調(diào)控的分子機(jī)制，為提高微藻脂質(zhì)產(chǎn)量的基因調(diào)控工程提供理論基礎(chǔ)．

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與培養(yǎng)條件

萊茵衣藻C.reinhardtiiCC849購(gòu)自美國(guó)衣藻資源中心．C.reinhartiiDLC藻株[7]來自深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn)入了含acs2-cis1反向重復(fù)片段的pmaa7/XIR沉默載體，以及含dof表達(dá)片段(受RBCS2-HSP70A熱激啟動(dòng)子調(diào)控)的pJD表達(dá)載體． 大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli) Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司．

利用三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽-磷酸培養(yǎng)基，將藻株于25 ℃、100 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度條件下培養(yǎng)．待培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，于水浴鍋中40 ℃熱激30 min，室溫下恢復(fù)1 h后提取總核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序．樣品組包括無熱激處理工程藻株(DLC)、野生型藻株(WT)、熱激處理工程藻株(HDLC)及熱激處理野生型藻株(HWT)，各組分別設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)．待繼續(xù)培養(yǎng)至第6天進(jìn)行TAG及淀粉的檢測(cè)．

1.2 TAG含量的檢測(cè)

BODIPY 505/515為油脂熒光染料，其與藻細(xì)胞內(nèi)的脂滴結(jié)合后在激光照射下發(fā)綠色熒光，故熒光強(qiáng)度的高低直接反映胞內(nèi)TAG的含量，檢測(cè)過程為：① 取1.5 mL的藻液，于5 000 r/min離心5 min回收藻細(xì)胞；② 用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)(0.01 mol/L)沖洗2～3 遍后，4 000 r/min離心2 min；③ 通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用PBS將體系稀釋至2×106～6×106/mL；④ 取980 μL的稀釋藻液至流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)的細(xì)胞管中，再取20 μL含10 μg/mL BODIPY 505/515 染液(Thermo Fisher Scientific)的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液加入；⑤ 以不加染液的藻液為陰性對(duì)照，在異硫氯熒光素(fluoresceinisothiocyanate, FITC)通道中，激發(fā)光480 nm、發(fā)射光510 nm下對(duì)1×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行熒光值讀數(shù)．

1.3 淀粉含量的測(cè)定

① 取5 mL藻液離心(12 000 r/min，10 min)，棄上清；② 取700 μL經(jīng)淀粉提取試劑盒(Solarbio)提取后的提取液，加入100 μL蒸餾水稀釋8倍；③ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：采用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)0.2、 0.1、 0.05、 0.025、 0.012 5、0.006 25、0.003 125及0.001 56 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在620 nm處的吸光度；以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此得到線性函數(shù)方程；④ 在樣品測(cè)量前先檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品以校正：混合0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液與1 mL 淀粉提取劑，95 ℃下水浴加熱10 min，待冷卻后以同體積蒸餾水的吸光度為空白對(duì)照值,分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度,并與據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算出的葡萄糖濃度進(jìn)行比較校準(zhǔn)；⑤ 測(cè)定各組樣品提取液在620 nm處的吸光度，將依照標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)計(jì)算所得的淀粉質(zhì)量濃度ρ值(單位：mg/mL)代入式(1),即可計(jì)算出各樣品(鮮質(zhì)量)中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(單位：mg/g).

w=ρVn/m

(1)

其中，V為稀釋后淀粉提取液的體積(單位： mL)；m為樣品藻細(xì)胞的鮮質(zhì)量(單位： g);n為稀釋倍數(shù)．

1.4 總RNA的提取與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取

利用RNAiso Plus(Takara)試劑盒提取各組樣品的總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific)測(cè)定RNA濃度和純度，以及質(zhì)量濃度為10 g/L的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量后，構(gòu)建互補(bǔ)核糖核酸(complementary dexyribonucleic acid, cDNA)文庫(kù)，并委托華大基因測(cè)序，每個(gè)樣品組分別進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)序．

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

1.5.1 原始數(shù)據(jù)處理及參考基因組比對(duì)

文庫(kù)測(cè)序完成后得到原始數(shù)據(jù)(raw reads)，通過SOAP nuke軟件(v 1.4.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用軟件Trimmomatic(v 0.36)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，排除帶有測(cè)序接頭、未知堿基數(shù)量大于5%和質(zhì)量低的數(shù)據(jù)(reads)，得到過濾后數(shù)據(jù)(clean reads)；利用HISAT2 軟件[8](v 2.1.0)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，使用Bowtie2軟件[9](v 2.2.5)與參考基因比對(duì)，采用RNA-seq by expectation maximization(RSEM)軟件包[10](v 1.2.8)計(jì)算基因表達(dá)豐度，并以FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)表示．

1.5.2 差異表達(dá)基因的篩選與富集分析

使用華大基因Dr.Tom系統(tǒng)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，設(shè)定差異表達(dá)倍數(shù)(fold change)≥ 2、Q值(校正后的P值)≤0.001， 得到初步的DEGs；再進(jìn)一步篩選HWT藻株中FPKM值大于等于1.5的DEGs，并據(jù)京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)的注釋結(jié)果及官方分類對(duì)DEGs進(jìn)行通路聚類及富集分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 TAG及淀粉含量的變化

經(jīng)BODIFY 505/515染色法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DLC藻株的熒光強(qiáng)度較WT藻株升高了70%(圖1)，且HDLC藻株的熒光強(qiáng)度較HWT藻株提高了118%，說明3基因的共調(diào)控能促進(jìn)萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)的TAG合成． HDLC藻株的熒光強(qiáng)度較DLC藻株提高了77%，且HDLC藻株的熒光強(qiáng)度較WT藻株提高了193%，說明熱激誘導(dǎo)進(jìn)一步增強(qiáng)dof基因的過表達(dá)后，3基因的共調(diào)控使得萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成進(jìn)一步顯著增強(qiáng)．

**為P< 0.01, t 檢驗(yàn) (n=3)圖1 萊茵衣藻內(nèi)TAG含量的變化Fig.1 TAG content of C.reinhardtii

DLC與WT藻細(xì)胞中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為122.99 mg/g和134.29 mg/g，二者無顯著性差異，但HDLC藻株中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)比HWT藻株的少了30%(圖2)，而HDLC藻株中的脂質(zhì)質(zhì)量較高，說明3基因共調(diào)控藻株中的碳流發(fā)生了重新定向，使得糖類合成通路中的代謝物流向脂質(zhì)合成通路中被利用．

2.2 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)

將WT、HWT和HDLC三組藻細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行比對(duì)．WT與HWT、HWT與 HDLC兩組之間統(tǒng)計(jì)得1 665個(gè)共同的DEGs，其中，F(xiàn)PKM值≥1.5的DEGs有749個(gè)，543個(gè)為上調(diào)基因，206個(gè)為下調(diào)基因．

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG聚類與富集分析

差異表達(dá)基因的KEGG pathway分類結(jié)果如圖3，分別有51個(gè)和15個(gè)DEGs參與碳水化合物代謝與脂質(zhì)代謝．

進(jìn)一步對(duì)這兩種代謝途徑中的DEGs進(jìn)行富集分析，結(jié)果如圖4．由圖4可見，在碳水化合物代謝中，富集在糖酵解及糖異生的DEGs編碼乙酰輔酶A合成酶、丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶等；富集在淀粉與蔗糖代謝的DEGs編碼內(nèi)切葡聚糖酶、1, 3-β-葡聚糖合酶和果膠酯酶等；此外，還有DEGs富集在三羧酸循環(huán)和光合有機(jī)體中的碳固定等代謝過程．

圖3 差異基因的KEGG聚類分析Fig.3 KEGG pathway classification of differentially expressed genes

圖4 差異基因在碳水化合物代謝通路中的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of differentially expressed genes in carbohydrate metabolism

由圖5可見，在脂質(zhì)代謝過程中，富集在甘油三酯代謝的DEGs編碼醇脫氫酶等；富集在甘油磷脂代謝的DEGs編碼溶血磷脂酶Ⅱ和乙醇胺-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶等；富集在脂肪酸降解的DEGs編碼乙酰輔酶A-乙酰基轉(zhuǎn)移酶和?；o酶A氧化酶Ⅰ等；還有DEGs富集在脂肪酸碳鏈延伸過程．通路中富集的關(guān)鍵DEGs的分布及其注釋信息如表1，其中，N為差異倍數(shù)．

圖5 差異基因在脂質(zhì)代謝通路中的集分析Fig.5 Enrichment analysis of differentially expressed genes in lipid metabolism

表1 脂質(zhì)及碳水化合物代謝途徑中關(guān)鍵差異表達(dá)基因的注釋

上述脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步表明3基因調(diào)控下萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的增加，不僅是由于脂質(zhì)合成代謝的增強(qiáng)，還可能是因?yàn)楦视王ズ椭舅峤到獾纫灾|(zhì)為起始反應(yīng)物的途徑被弱化．此外，還可能是由于糖類等其他非脂物質(zhì)的生物合成途徑減弱，使得更多的共同代謝中間物流向脂質(zhì)合成途徑而被充分利用．

3 討 論

脂質(zhì)合成代謝中的甘油三酯代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝等途徑與糖代謝中的糖酵解、糖異生和淀粉代謝等途徑相關(guān)聯(lián)，因此，若其他代謝通路含有生成三磷酸甘油、甘油、乙酰輔酶A和脂肪酸等共同中間代謝產(chǎn)物，則能在一定的調(diào)控條件下改變碳流的偏向，促進(jìn)脂質(zhì)合成代謝． ACS2和CIS1分別參與脂質(zhì)合成及糖代謝中的關(guān)鍵反應(yīng)，而DOF轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)碳氮代謝中多通路的調(diào)控，則3基因的共同調(diào)控定能引起其他關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化．

在甘油三酯代謝中， 醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)能將甘油氧化為D-甘油醛，再被甘油脫氫酶催化為甘油．有研究表明，編碼ADH及乙酰乙酸脫羧酶等參與乙酰輔酶A代謝的基因的共同過表達(dá)導(dǎo)致大腸桿菌內(nèi)的脂肪酸異丙基酯達(dá)203.4 mg/L[11]．與WT藻細(xì)胞相比，ADH在HWT 藻細(xì)胞中的表達(dá)水平下降；而相比于HWT藻細(xì)胞，ADH在HDLC中表達(dá)水平上調(diào)，說明3基因調(diào)控下ADH的上調(diào)可能導(dǎo)致甘油的增加而增強(qiáng)脂質(zhì)合成代謝．

在甘油磷脂代謝中，三磷酸甘油是重要的中間產(chǎn)物．相較HDLC藻細(xì)胞中溶血磷脂酶Ⅱ(lysophospholipase Ⅱ, LYPLA2)及乙醇胺-磷酸胞苷轉(zhuǎn)移酶2(phosphate cytidylyltransterase 2, PCYT2)的表達(dá)量增加，LYPLA2以2-?；视?3-磷酸膽堿為底物，催化生成甘油-3-磷酸膽堿，隨后被轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油；而PCYT2將磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)化為CDP-乙醇胺，產(chǎn)物經(jīng)接連反應(yīng)后被轉(zhuǎn)化為三磷酸甘油．WEPY等[12]發(fā)現(xiàn)LYPLA1和LYPLA2共同調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)代謝的平衡，任何一方的活性缺失均會(huì)導(dǎo)致溶血磷脂的增加；PAVLOVIC等[13]則發(fā)現(xiàn)pcyt2的沉默導(dǎo)致小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)磷脂酰乙醇胺合成的提高，使得膜脂增加．因此，熱激后3基因的調(diào)控下LP2、 PCYT2的表達(dá)上調(diào)可能抑制膜脂的合成,使得脂質(zhì)的生物合成進(jìn)程偏向三酰甘油的合成．

在脂肪酸降解途徑中，乙酰輔酶A是由脂肪酸β-氧化和糖酵解終產(chǎn)物丙酮酸經(jīng)氧化脫羧產(chǎn)生的，在有機(jī)體中的許多代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用．β-氧化的連續(xù)周期反應(yīng)過程中，每一步反應(yīng)中長(zhǎng)鏈脂肪酸脫去含兩個(gè)碳原子的碎片而被氧化為逐縮短碳鏈的脂酰輔酶A，從而產(chǎn)生乙酰輔酶A[14]．相比HWT藻細(xì)胞，HDLC藻細(xì)胞中酰基輔酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase, ACOX1)和乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(acyl-CoA acyltransferase, ACAT)的表達(dá)量上調(diào)． ACOX1參與多種堿基輔酶A的氧化反應(yīng)，促進(jìn)脂肪酸的氧化分解[15]；而ACAT催化短鏈脂肪酸的氧化反應(yīng)，生成乙酰輔酶A[16]．故而兩個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)可能一定程度上促進(jìn)脂肪酸的氧化分解，加快乙酰輔酶A 循環(huán)流的流動(dòng)，進(jìn)而提高脂肪酸合成的中間產(chǎn)物循環(huán)效率．

丙酮酸既是糖酵解途徑的終產(chǎn)物，也為糖異生途徑的起始反應(yīng)物．作為乙酰輔酶A的合成前體，丙酮酸與脂質(zhì)合成代謝有著緊密的聯(lián)系．在糖酵解及糖異生代謝中，相較于HWT藻細(xì)胞，HDLC藻細(xì)胞中的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphcrte isomerases, G6PI)、 丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)及乙酰輔酶A合成酶(acyl-CoA synthetase, ACS)表達(dá)水平更高．G6PI催化α-D-6-磷酸葡萄糖和β-D-6-磷酸葡萄糖間的相互轉(zhuǎn)變，及兩者向β-D-6-磷酸果糖的轉(zhuǎn)變．β-D-6-磷酸果糖繼而在相關(guān)酶作用下的產(chǎn)物為磷酸烯醇丙酮酸，接而經(jīng)PK產(chǎn)生丙酮酸．另一方面，乙醇被氧化為乙醛、醋酸后，經(jīng)ACS合成乙酰輔酶A．有報(bào)道表明， 敲除編碼G6PI的基因后，鼠細(xì)胞中甘油酯含量減少，且油脂代謝中的磷脂酸磷酸酶Ⅰ基因也隨之出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)[17]；在萊茵衣藻中過表達(dá)ACS2后，導(dǎo)致葉綠體中碳流向乙酰輔酶A合成的方向富集，從而使得三酰甘油含量提高了2.4倍[18]．G6PI、 PK及ACS的表達(dá)上調(diào)可能通過增加丙酮酸、乙酰輔酶A的含量以增強(qiáng)脂質(zhì)合成代謝．

在淀粉代謝中，α-D-葡萄糖-1-磷酸為重要的代謝中間物質(zhì)，磷酸葡萄糖變位酶能將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，即丙酮酸的前體．相比HWT藻株，HDLC藻株中內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1, 4-β-D-glucanohydrolase, EGA)、 葡聚糖合酶(glucan synthase, BGS)和果膠酯酶(pectinesterase, PA)均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)．PA促進(jìn)ADP-葡萄糖(由α-D-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化而來)生成直鏈淀粉；BGS利用α-D-葡萄糖-1-磷酸合成1，3-β-D葡聚糖，繼而被轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖；EGA則利用以α-D-葡萄糖-1-磷酸為底物合成的纖維素，合成纖維糊精，而后經(jīng)系列反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)镈-葡萄糖．淀粉代謝途徑中3個(gè)關(guān)鍵DEGs的下調(diào)可能抑制消耗α-D-葡萄糖-1-磷酸的反應(yīng)過程，間接等導(dǎo)致丙酮酸含量的增加，從而使得碳流定向于脂質(zhì)合成代謝．

結(jié) 語

沉默acs2和cis1基因且過表達(dá)DOF轉(zhuǎn)錄因子的3基因共調(diào)控重定向碳氮代謝中的碳流流向，增強(qiáng)了脂質(zhì)合成代謝，為萊茵衣藻脂質(zhì)合成代謝機(jī)制研究提供了理論參考，為研究微藻細(xì)胞代謝定向調(diào)控提供方法．針對(duì)以上差異基因富集的代謝通路，后續(xù)將對(duì)構(gòu)建的高油脂藻株進(jìn)行深入的油脂代謝轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌機(jī)制的研究．