衣藻二氧化碳濃縮機(jī)制及其調(diào)控的研究進(jìn)展

秦燕 范波 苗貴東

摘要 當(dāng)?shù)蜐舛菴O2限制微藻光合作用時(shí)，CO2濃縮機(jī)制（CCM）是一種有效的無機(jī)碳（Ci）吸收策略，以保證微藻的正常生存和繁殖。CCM主要是通過升高1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）附近的CO2濃度增強(qiáng)光合作用的效率，同時(shí)抑制光呼吸的進(jìn)行。CCM的關(guān)鍵步驟包括無機(jī)碳的聚集吸收、Rubisco對(duì)CO2的固定和碳酸酐酶催化的不同Ci的轉(zhuǎn)換。CCM中分子調(diào)控元件的有序協(xié)作，不僅可以幫助細(xì)胞感知周圍CO2的濃度，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)CCM基因的表達(dá)，還可以協(xié)調(diào)衣藻在低濃度CO2環(huán)境下光合作用中碳和其他代謝途徑的相互作用。總結(jié)了目前以衣藻作為模式生物對(duì)真核藻類CCM的研究概況、調(diào)控機(jī)理，以及CCM機(jī)制在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用和展望。

關(guān)鍵詞 衣藻;二氧化碳濃縮機(jī)制;調(diào)控機(jī)理;無機(jī)碳吸收系統(tǒng)

中圖分類號(hào) Q949.21? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）04-0020-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.006

Research Progress on the CO2 Concentrating Mechanism and Its Regulation in Chlamydomonas

QIN Yan，F(xiàn)AN Bo，MIAO Gui-dong （College of Biology and Chemistry，Xingyi Normal University for Nationalities，Xingyi，Guizhou 562400）

Abstract CO2 concentrating mechanism （CCM） is an effective way for carbon assimilation that enables microalgae to survive and proliferate in the limiting CO2 concentration.CCM can improve the CO2 concentration near the Rubisco to enhance the photosynthetic efficiency and suppress the photorespiration.The key components of CCM include inorganic carbon （Ci） uptake，Ci fixation by Rubisco and the interconversion of different Ci catalyzed by CA.An array of the molecular regulatory elements can facilitate cells to sense the CO2 concentration，regulate the expression of the CCM and to coordinate the photosynthetic carbon metabolism and other metabolic processes in response to limiting CO2 conditions.This review summarized the current understanding of the eukaryotic algal CCM，based largely on chlamydomonas as a model organism，to illustrate how chlamydomonas adapts to the limiting CO2 and how its CCM was regulated.

Key words Chlamydomonas;CO2 concentrating mechanism;Regulation mechanism;Ci absorption system

基金項(xiàng)目

貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔教合KY字〔2019〕221號(hào)）;興義民族師范學(xué)院博士科研基金項(xiàng)目（18XYBS02）;黔西南州2019年州級(jí)科技計(jì)劃自籌資金項(xiàng)目（2019-2-50）。

作者簡(jiǎn)介 秦燕（1980—），女，山東萊蕪人，副教授，博士，從事細(xì)胞與分子生物學(xué)研究。

收稿日期 2020-07-11

光合作用中的碳代謝可稱為地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，地球上全部綠色植物的生長(zhǎng)都離不開光合作用，是全球碳循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。光合作用過程中核心的途徑是卡爾文循環(huán)（CCB），此循環(huán)包含一系列的生化反應(yīng)，通過這些反應(yīng)無機(jī)碳（Ci）轉(zhuǎn)化成有機(jī)碳，并將太陽(yáng)能儲(chǔ)存在碳水化合物中。CCB循環(huán)最初是在綠藻Chlorella和Scenedesmus中闡明的[1]。綠藻中的萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，逐漸成為模式生物來研究生物學(xué)的熱點(diǎn)問題，如光合作用、光合趨光性、鞭毛/纖毛生物學(xué)、藻脂生物學(xué)。因?yàn)橐略迨且环N單倍體生物，生活周期短、遺傳背景清楚，衣藻的光合作用結(jié)構(gòu)、光合作用中的光反應(yīng)和暗反應(yīng)中碳的代謝與高等植物非常相似[2-5]，因此在衣藻中的很多發(fā)現(xiàn)可以直接適用于高等植物。衣藻作為一種生活在特殊環(huán)境中的單細(xì)胞生物，與其他藻類一樣，有其獨(dú)特和靈活的代謝特征和基因表達(dá)調(diào)控的獨(dú)特機(jī)制，使其能夠在外界條件波動(dòng)極大的環(huán)境中生存下來[3-4，6-7]。

光合自養(yǎng)的生物已經(jīng)進(jìn)化出許多適應(yīng)策略來應(yīng)對(duì)周圍各種不利的環(huán)境條件，其中一個(gè)例子就是CO2濃縮機(jī)制（CCM），這是藍(lán)細(xì)菌和真核微藻為適應(yīng)地球上古老大氣中CO2濃度降低和O2濃度升高進(jìn)化出來的一種響應(yīng)機(jī)制。 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用過程中碳吸收的核心酶，它在CCB循環(huán)中催化第一步也是最重要的一步羧化反應(yīng)，催化CO2與RuBP的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)無機(jī)碳向有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化。Rubisco是一種古老的酶，進(jìn)化中存在于高濃度CO2低濃度O2的環(huán)境中。目前大氣中的CO2濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Rubisco羧化酶的活性所需要的飽和濃度，大氣中高比率的O2/CO2提高了Rubisco加氧酶的活性，這使其進(jìn)入既消耗能量又釋放CO2的光呼吸途徑[8]。CCM機(jī)制則通過彌補(bǔ)Rubisco羧化酶效率低的特點(diǎn)，提高CO2濃度，增加光合作用的效率。目前在植物中已經(jīng)進(jìn)化出不同的策略提高Rubisco附近CO2濃度，增強(qiáng)Rubisco羧化酶的活性同時(shí)降低加氧酶活性，實(shí)現(xiàn)高效率的光合作用。這些策略出現(xiàn)在不同類群植物的不同發(fā)育階段，包括高等植物中多樣化的C4代謝途徑和微藻、藍(lán)細(xì)菌中多樣化的CCMs[9-10]。

CCM與藻類植物光合作用、代謝活動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育等方面密切相關(guān)，也是提高藻類生物量的關(guān)鍵因素。了解CCM可以更好地理解這些微觀的生產(chǎn)者們是如何影響全球環(huán)境的，并可指導(dǎo)對(duì)藻類進(jìn)行遺傳和分子手段的操作，以提高其生物產(chǎn)量。對(duì)CCM機(jī)制的理解，還有助于實(shí)現(xiàn)人工設(shè)計(jì)將藻類特定特征引入到C3植物提高其光合效率[11-12]。藍(lán)細(xì)菌的CCM已經(jīng)在幾個(gè)模式藍(lán)細(xì)菌中得到廣泛研究[13]。近幾年，以衣藻作為真核光合模式生物，對(duì)CCM分子機(jī)制的理解也有了極大的進(jìn)步。筆者主要是結(jié)合目前對(duì)衣藻CCM的理解及與無機(jī)碳吸收的相互作用，來總結(jié)衣藻是如何適應(yīng)低CO2濃度的環(huán)境條件以及它的CCM是如何調(diào)節(jié)的。

1 CO2濃縮機(jī)制的概述

微藻CCM是基于單細(xì)胞的CO2濃縮機(jī)制，其依賴于多種無機(jī)碳吸收系統(tǒng)（圖1）。這些無機(jī)碳吸收系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)形成以HCO3-為主的Ci庫(kù)，庫(kù)內(nèi)的CO2濃度比水中的CO2濃度高1 000倍，這可能是目前已知最有效的Ci吸收系統(tǒng)[14]。CCM主要是通過升高Rubisco附近的CO2濃度增強(qiáng)光合作用的效率，同時(shí)抑制光呼吸的進(jìn)行。

CCM是一種非常靈活調(diào)控的機(jī)制，可適應(yīng)多種低濃度的CO2條件，通過不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與其他生理過程協(xié)調(diào)，如光合作用、光呼吸中的碳代謝、細(xì)胞周期和晝夜節(jié)律等。微藻在多種低CO2濃度條件下發(fā)生了一系列的適應(yīng)性反應(yīng)，包括CCM基因的誘導(dǎo)表達(dá)、代謝活動(dòng)的變化、生理的變化等。許多CCM研究將自然界的CO2濃度區(qū)分為2種生理狀態(tài)：高CO2濃度狀態(tài)（CO2 濃度1%～5%）和受限制的低CO2濃度狀態(tài)（CO2濃度0～0.03%）。事實(shí)上，自然界存在多種CO2濃度的環(huán)境條件，如有的藻類生活在CO2濃度高的土壤中，有的生活在富含有機(jī)質(zhì)的CO2濃度極低的水生條件。微藻在多種CO2濃度條件下的適應(yīng)性研究都已被闡明，這反映了微藻可以適應(yīng)多種自然生境條件。

2 衣藻中的二氧化碳濃縮機(jī)制

本質(zhì)上講，CCM的核心是活性Ci的吸收系統(tǒng)，而活性Ci的吸收包括HCO3-的跨膜運(yùn)輸、CO2的吸收、碳酸酐酶（CA）對(duì)不同狀態(tài)Ci的轉(zhuǎn)化和遺漏CO2的重新捕獲。在衣藻中，Ci的吸收主要發(fā)生在質(zhì)膜、葉綠體膜和葉綠體類囊體膜上[15]。通過轉(zhuǎn)錄組分析，確定了許多低CO2濃度條件下響應(yīng)的基因如編碼Ci的轉(zhuǎn)運(yùn)體、CO2吸收系統(tǒng)和CA（表1）。通過對(duì)CCM突變體的分子生物學(xué)研究，確定出許多Ci吸收的關(guān)鍵成分。在受限制的低CO2濃度條件下，不同的膜Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體、CO2吸收系統(tǒng)和不同的CA參與了CCM的過程[14]（圖2）。這些Ci吸收系統(tǒng)通過一系列調(diào)控元件的調(diào)控，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平2個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)，使衣藻快速地適應(yīng)不同的環(huán)境條件。

以下主要介紹了活性Ci如何從細(xì)胞外通過各種膜系統(tǒng)進(jìn)入到類囊體基質(zhì)中的過程，以及膜上和膜內(nèi)有哪些Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白參與了此過程。

2.1 細(xì)胞表面

在水生環(huán)境中，有CO2和HCO3-這2種無機(jī)碳形式。當(dāng)CO2在液相和氣相達(dá)到平衡時(shí)，溶解CO2的量取決于氣相中CO2的分壓，但是水中的CO2擴(kuò)散速率比空氣中慢104倍。水中CO2轉(zhuǎn)化成HCO3-的速率依賴于pH。因?yàn)樘妓狒傅慕怆x常數(shù)（pKa值）接近6.4，在中性到堿性pH時(shí)，HCO3-占主導(dǎo)地位。為了保持細(xì)胞表面有足夠多的HCO3-和CO2，需要大量有活性的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體或有活性的CO2吸收系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)大量的Ci流，這就需要有多個(gè)CA維持Ci的供應(yīng)來保持HCO3-和CO2的平衡。CAH1是質(zhì)膜外的碳酸酐酶，該蛋白在受限制的低CO2濃度條件下誘導(dǎo)表達(dá)，其功能可能是維持質(zhì)膜HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸?shù)腍CO3-的平衡或活性CO2吸收系統(tǒng)中CO2的平衡[16]。

2.2 穿越質(zhì)膜

Ci進(jìn)入細(xì)胞的第一道屏障是質(zhì)膜。因?yàn)榧?xì)胞膜對(duì)帶電荷的Ci如HCO3-是不能通透的，所以Ci進(jìn)入細(xì)胞需要膜上的Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)助。 目前已經(jīng)從衣藻中鑒定出2個(gè)HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體HLA3和LCI1參與此過程。

HLA3是一種定位于質(zhì)膜上的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，含有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體特有的結(jié)構(gòu)域，在衣藻和很多綠藻中都發(fā)現(xiàn)了HLA3轉(zhuǎn)運(yùn)體，該蛋白在CO2濃度低時(shí)發(fā)揮作用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的HCO3-的吸收在藍(lán)細(xì)菌中也有報(bào)道[13]。

LCI1是質(zhì)膜上的另一個(gè)Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體[17]。該蛋白有幾個(gè)預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域，但是未鑒定出具有功能的模體。如果在lcr1突變體中過表達(dá)LCI1可以在低CO2濃度下提高光合作用對(duì)Ci的親和力，并能促進(jìn)HCO3-的吸收[18]。此蛋白對(duì)Ci種類吸收的偏好性仍不清楚。與其他參與Ci吸收的蛋白不同，LCI1蛋白被認(rèn)為是一種孤兒蛋白，即在與衣藻親緣關(guān)系很近的物種（即使在團(tuán)藻Volvox）中，沒有確定出序列同源物，只在衣藻和其他幾個(gè)綠藻基因組中預(yù)測(cè)出幾個(gè)膜蛋白與該蛋白的空間結(jié)構(gòu)相似。

2.3 細(xì)胞質(zhì)內(nèi) 目前仍不清楚胞質(zhì)中哪些成分參與活性Ci的吸收以及Ci是否會(huì)在胞質(zhì)中積累。如果胞質(zhì)中Ci濃度低時(shí)，則需要CA的存在捕獲更多的CO2。自然界中，CA一般分為α、β、γ 3類，目前從衣藻中已經(jīng)鑒定出12個(gè)編碼碳酸酐酶蛋白的基因CAs，包括3種α-CAs、6種β-CAs和3種γ-CAs，分別定位于線粒體（5個(gè)）、葉綠體基質(zhì)（1個(gè)）、類囊體基質(zhì)（1個(gè)）、胞質(zhì)（1個(gè)）、壁膜間隙（3個(gè)），CAH7的定位仍然未知[19]。定位于胞質(zhì)中的CAH9蛋白，其基因序列獨(dú)特，與其他幾種基因的序列差別較大，目前功能未知。定位于線粒體中的CAH4、CAH5，兩者的核酸序列高度相似可達(dá)95%，均形成反向重復(fù)的結(jié)構(gòu)[19]，這2個(gè)蛋白在受限制的CO2濃度下可被誘導(dǎo)大量表達(dá)，但這2個(gè)蛋白的功能未知，有可能不直接在CCM中發(fā)揮作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)如果將衣藻細(xì)胞從CO2濃度高的區(qū)域移動(dòng)到CO2濃度低的區(qū)域，線粒體將會(huì)從中間位置移動(dòng)到靠近質(zhì)膜的位置，這種線粒體位置的移動(dòng)可能是因?yàn)橘|(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)體的電荷發(fā)生變化引起的[21]。

2.4 穿越葉綠體膜

Ci吸收過程中的另一道障礙是葉綠體膜。有人從衣藻中分離出游離葉綠體，在葉綠體中觀察到了活性Ci吸收的整個(gè)過程，并鑒定出許多葉綠體膜上的Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體[17]。

LCIA是唯一確定參與低CO2濃度下跨葉綠體膜轉(zhuǎn)運(yùn)HCO3-的蛋白。在衣藻中，LCIA是一個(gè)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)體，LCIA作為一種通道協(xié)助Ci進(jìn)入葉綠體，其發(fā)揮功能需要與質(zhì)膜上其他蛋白如HLA3或LCI1協(xié)同作用完成，它們共同將HCO3-逆著葉綠體膜上的電位轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體內(nèi)[15-22]。

葉綠體膜上還鑒定出CCP1和CCP2這2種Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體，這2個(gè)葉綠體蛋白幾乎完全相同，它們的序列與線粒體運(yùn)載蛋白超家族高度相似[23]。但是有人推測(cè)此蛋白可能不參與Ci吸收[24]，認(rèn)為或許CCP1/2的功能被掩蓋[20]或者它們只是參與了適應(yīng)低CO2濃度其他代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。有關(guān)CCP1/2在CCM中的功能需要更深入的研究。

葉綠體膜上另外一種膜蛋白CemA可能也是一種Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體，它是質(zhì)體ycf10基因的表達(dá)產(chǎn)物，ycf10基因的破壞會(huì)引起葉綠體中Ci吸收的降低[25]。此蛋白在藍(lán)細(xì)菌中的同源物對(duì)于CO2的傳遞是必不可少的[26]。

2.5 葉綠體基質(zhì)

葉綠體基質(zhì)中有很多蛋白參與Ci的積累。LCIB是廣泛分布于葉綠體基質(zhì)中的蛋白質(zhì)[15]，催化基質(zhì)中CO2轉(zhuǎn)化為HCO3-而保持基質(zhì)中Ci的積累，此功能類似藍(lán)細(xì)菌中ChpX和ChpY蛋白（也稱為CupA和CupB）[27]。一般認(rèn)為L(zhǎng)CIB只在極低CO2濃度下發(fā)揮功能。在一些真核藻類和多種藍(lán)細(xì)菌基因組中只發(fā)現(xiàn)一個(gè)LCIB的同源物[3，20，28]，可能LCIB是以單體的形式發(fā)揮功能。在極低CO2濃度下，LCIB與LCIA協(xié)同完成HCO3-的吸收[15]。但是LCIB參與的Ci吸收的分子機(jī)制沒有太多證據(jù)支持。

LCIB還與其同源物L(fēng)CIC形成異源多聚體LCIB/LCIC復(fù)合物[15]，但LCIC在Ci吸收中是否起作用仍不清楚。LCIB/LCIC復(fù)合物一般定位于2個(gè)分開的區(qū)域，分散在整個(gè)基質(zhì)中或集中分布在蛋白核周圍。在極低CO2濃度時(shí)，復(fù)合物會(huì)特異地定位于蛋白核周圍，在低CO2濃度或高CO2濃度時(shí)，復(fù)合物會(huì)分布在整個(gè)基質(zhì)中[15]。調(diào)控LCIB/LCIC復(fù)合物定位的分子機(jī)制還不清楚。

在衣藻葉綠體基質(zhì)中還有一種碳酸酐酶CAH6，其功能是在堿性基質(zhì)條件下將CO2轉(zhuǎn)化成HCO3-，以維持基質(zhì)中高濃度的Ci或者重新捕獲滲漏的CO2[29]。

除了LCIB/LCIC和CAH6以外，還發(fā)現(xiàn)了另外2種LCIB同源物——LCID和LCIE，推測(cè)它們可能在Ci吸收中起作用[30]。

2.6 類囊體和蛋白核

在大多數(shù)藻類中，Rubisco定位于葉綠體內(nèi)一個(gè)稱為蛋白核的結(jié)構(gòu)中（圖3）。在衣藻中，蛋白核是一個(gè)液體樣的細(xì)胞器，Rubisco的小亞基（SSU）和EPY1蛋白對(duì)蛋白核的形成起重要作用，利于其形成液體樣的結(jié)構(gòu)[31]。蛋白核外面被淀粉鞘包圍，淀粉鞘的形態(tài)直接影響蛋白核的數(shù)量和CCM的功能[32]。蛋白核由Rubisco的大小亞基組成[33]，在蛋白核內(nèi)部，HCO3-被碳酸酐酶CAH3催化脫水生成CO2，被附近的Rubisco羧化進(jìn)入卡爾文循環(huán)。碳酸酐酶CAH3催化HCO3-脫水轉(zhuǎn)化成CO2的效率很高，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ci的大量積累，可達(dá)到野生型的5倍[34]。Blanco-Rivero 等[35]將衣藻從高CO2濃度轉(zhuǎn)移到低CO2濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)CAH3被磷酸化，碳酸酐酶的活性提高，但CAH3蛋白的量并沒有增多，這說明CAH3翻譯后加工也可以調(diào)控CCM，使其適應(yīng)低CO2濃度條件。

利用原位低溫電子斷層掃描術(shù)已觀察到衣藻蛋白核的三維結(jié)構(gòu)[36]，顯示類囊體的垛疊層和蛋白核通過圓柱形的蛋白核小管連接在一起。在蛋白核小管中有成束的多個(gè)平行的小管。蛋白核小管上的CAH3催化平行小管中的HCO3-轉(zhuǎn)化成CO2，釋放到蛋白核中。

Rubisco主要分布在葉綠體基質(zhì)和蛋白核中，其動(dòng)態(tài)分布與CO2濃度有關(guān)：在受限制的低濃度CO2條件下，幾乎所有的Rubisco都分布在蛋白核中，而在高濃度CO2條件下，只有50%的Rubisco定位在蛋白核[33]。Rubisco的大小亞基對(duì)蛋白核的形成起重要作用[33]，尤其是小亞基含有重要的結(jié)構(gòu)元件，負(fù)責(zé)將Rubisco定位于蛋白核中。另外，蛋白CIA6和SAGA1也參與蛋白核的形成[37-38]。SAGA1可調(diào)節(jié)蛋白核周圍淀粉鞘的形態(tài)，但CIA6是否直接參與Rubisco的定位和誘導(dǎo)CCM基因表達(dá)仍不確定。

2.7 滲漏CO2的重新捕獲

蛋白核周圍的CO2如果沒有及時(shí)被Rubisco羧化，則會(huì)擴(kuò)散滲漏。而CO2屏障和CO2循環(huán)機(jī)制則可防止多余CO2的滲漏。 有研究表明，低CO2濃度下，蛋白CAH6和LCIB/LCIC復(fù)合物參與了滲漏CO2的重新捕獲過程[29，35];在極低CO2濃度下，蛋白CAH6、LCID或LCIE可重新固定滲漏的CO2。

3 衣藻中CCM的調(diào)控

3.1 低濃度CO2環(huán)境下CCM的調(diào)控

3.1.1 CCM相關(guān)基因的調(diào)控 。

CCM相關(guān)基因在低濃度CO2條件下會(huì)出現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)。轉(zhuǎn)錄水平上分析發(fā)現(xiàn)，許多CCM關(guān)鍵基因在受限制CO2濃度下表達(dá)會(huì)上調(diào)，如LCI1、LCIA、LCIB、HLA3及參與光呼吸的基因[14，17]。蛋白水平上分析發(fā)現(xiàn)，低CO2濃度條件下，許多蛋白如碳酸酐酶CAH1、CAH4和CAH5以及2個(gè)Ci轉(zhuǎn)運(yùn)體CCP1和CCP2也會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)[14]。

Brueggeman等[39]

對(duì)衣藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，并統(tǒng)計(jì)了低CO2濃度下基因調(diào)控的情況;當(dāng)把衣藻從高CO2濃度轉(zhuǎn)移至受限制的CO2濃度時(shí)，15 500個(gè)衣藻基因中14%～38%（2 200～5 880個(gè)）的基因表達(dá)發(fā)生改變;在低CO2濃度或者極低CO2濃度下，1 000～2 000個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，其中許多是CCM相關(guān)的基因[39]。另外，一些響應(yīng)CO2脅迫基因的表達(dá)水平發(fā)生了劇烈的變化，也包括很多重要的CCM基因，如Ci轉(zhuǎn)運(yùn)基因（LCI1、LCIA、HLA3、CCP1/2、LCIB等）和CA基因（CAH1、CAH4/5）[40]，其中有些是編碼可溶性蛋白和膜蛋白的功能未知的基因，這些基因可用來作為候選基因研究是否參與Ci轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收或其他CCM的功能。另外，有些基因在低CO2濃度下高表達(dá)、高CO2濃度下不表達(dá)，如LCI1、LCIA、LCR1、HLA3、CCP1、CAH4/5等;也有些CCM關(guān)鍵基因如LCIB和CAH3在低CO2濃度下則表達(dá)水平顯著上調(diào)，而在高CO2濃度下表現(xiàn)為低水平的組成型表達(dá)，說明這些基因可能參與了低CO2濃度下CCM的過程。

3.1.2 調(diào)控CCM基因表達(dá)的元件。大量證據(jù)證明，在衣藻中存在一個(gè)從多層面調(diào)控CCM表達(dá)的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，但是對(duì)CCM調(diào)控的分子機(jī)制仍不清楚。目前只有2種調(diào)控蛋白CIA5（也稱CCM1）和LCR被確認(rèn)可能調(diào)控衣藻中CCM相關(guān)基因的表達(dá)。

3.1.3 CCM基因的翻譯后調(diào)控。

基因的翻譯后調(diào)控在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中廣泛存在，這種機(jī)制比轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控更能使細(xì)胞快速地應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化。很早就有研究表明衣藻為了適應(yīng)受限制CO2濃度會(huì)發(fā)生蛋白磷酸化，但是CCM相關(guān)蛋白的磷酸化是最近才鑒定出來的，如將衣藻從高濃度CO2轉(zhuǎn)移到受限制CO2濃度時(shí)，2個(gè)類囊體蛋白LCI5和UEP發(fā)生了磷酸化[41]， 以及CAH3在受限制CO2濃度時(shí)也發(fā)生了磷酸化。對(duì)衣藻的磷酸化蛋白組進(jìn)行系統(tǒng)分析也發(fā)現(xiàn)了許多CCM相關(guān)蛋白的磷酸化，如HLA3、LCIC、LCID、LCI15、CAs以及低CO2濃度下誘導(dǎo)表達(dá)的其他蛋白[42]。

除了磷酸化，蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化也是一種翻譯后調(diào)控，如在衣藻中的LCIB和許多參與卡爾文循環(huán)的蛋白[43]。另外，CIA5中存在的SUMO的修飾位點(diǎn)可能也是一種翻譯后調(diào)控機(jī)制，盡管功能未知。

在衣藻適應(yīng)受限制CO2濃度時(shí)可能存在多種翻譯后修飾作為信號(hào)，但這些修飾的分子機(jī)制仍不確定。

3.2 低CO2濃度條件下碳同化的調(diào)控

衣藻光合作用的光反應(yīng)和暗反應(yīng)過程與高等植物非常相似[20]，然而衣藻因?yàn)榫哂衅洫?dú)特而靈活的碳代謝特征以及細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特的區(qū)室化，使其能夠在不同的環(huán)境中生存和繁殖[3]。在衣藻中，前期固定的Ci最終都要進(jìn)入卡爾文循環(huán)：CO2首先與五碳化合物RuBP在Rubisco的催化下生成兩分子的3-磷酸甘油酸（3-PGA），然后通過兩步反應(yīng)將3-PGA還原成3-磷酸甘油醛，此步反應(yīng)將會(huì)消耗光反應(yīng)中產(chǎn)生的ATP和NADPH，而后3-磷酸甘油醛經(jīng)過一系列反應(yīng)重新生成RuBP，其中產(chǎn)生的許多中間產(chǎn)物可參與細(xì)胞內(nèi)其他代謝途徑。Rubisco除了催化RuBP與CO2的羧化反應(yīng)，還會(huì)催化RuBP與O2的加氧反應(yīng)，此反應(yīng)產(chǎn)生一分子的3-PGA和一分子的磷酸乙醇酸，進(jìn)入光呼吸代謝途徑。當(dāng)外界環(huán)境條件中CO2濃度受限制時(shí)，則會(huì)有一些代謝的碳從卡爾文循環(huán)中流入光呼吸代謝途徑。然而，在低CO2濃度條件下，衣藻的卡爾文循環(huán)和光呼吸這2種代謝途徑都會(huì)被調(diào)控以適應(yīng)底物濃度受限的條件。

3.2.1 卡爾文循環(huán)。

在衣藻中已經(jīng)鑒定出卡爾文循環(huán)的全部基因，這些基因在高CO2濃度和受限制的低CO2濃度的條件下均發(fā)揮作用。研究表明，大多數(shù)卡爾文循環(huán)中的酶受底物濃度限制，有些酶的濃度比其底物還高[44]。在細(xì)胞內(nèi)只有幾種酶的濃度是與底物濃度相似接近飽和的，如Rubisco、FBP（1，6-二磷酸果糖酶）、SBP（1，7-二磷酸景天庚酮糖酶），通過調(diào)節(jié)這些酶的活性來提高光合效率是一種翻譯后調(diào)控過程。

為適應(yīng)低CO2濃度條件，衣藻卡爾文循環(huán)中的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，如Rubisco亞基RbcS1、RbcS2和RbcL的轉(zhuǎn)錄表達(dá)會(huì)升高;Rubisco小亞基RBCS1、ALD3（醛縮酶）、PGK（磷酸甘油酸激酶）、GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）和SBP的轉(zhuǎn)錄水平則會(huì)下調(diào)。有研究表明，卡爾文循環(huán)中酶的蛋白數(shù)量的變化并非與轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的變化一致[44]?？栁难h(huán)的調(diào)控可能是翻譯后修飾或者底物抑制/激活等方面。許多卡爾文循環(huán)酶通過翻譯后修飾如谷胱甘肽化或鐵氧還蛋白二硫鍵的變化進(jìn)行氧化還原調(diào)控[43，45]。氧化還原調(diào)控是建立起來的一種很好的系統(tǒng)，可將光合作用中的光反應(yīng)和暗反應(yīng)融合在一起，使細(xì)胞在適應(yīng)多變環(huán)境時(shí)通過不同的細(xì)胞過程進(jìn)行能量的分配。

3.2.2 光呼吸。

當(dāng)周圍環(huán)境中CO2/O2比率降低時(shí)，Rubisco加氧酶的活性增強(qiáng)，產(chǎn)生磷酸乙醇酸，進(jìn)入光呼吸代謝途徑，抑制磷酸丙糖異構(gòu)酶的活性，從而干擾RuBP的再生。轉(zhuǎn)錄組水平和代謝水平的研究表明將衣藻從高濃度CO2轉(zhuǎn)移到低濃度CO2后，衣藻會(huì)有一個(gè)快速且短暫的光呼吸代謝的升高過程。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)將衣藻細(xì)胞從高濃度CO2轉(zhuǎn)入低濃度CO2 4 h后，編碼丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的基因、甘油酸激酶（GLYK）的基因、乙醇酸脫氫酶（GYD1）的基因、羥基丙酮酸還原酶1（HPR1）的基因、絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（SGA1）的基因和所有編碼甘氨酸脫羧酶亞基的基因（二氫硫辛酸脫氫酶1DLDH1除外）均出現(xiàn)基因表達(dá)的上調(diào)[40]，這些基因的表達(dá)受CO2濃度和CIA5的調(diào)控。代謝組學(xué)的研究表明，光呼吸途徑中的中間產(chǎn)物如甘氨酸、甘油酸鹽、乙醛酸絲氨酸和3-磷酸甘油醛的量會(huì)明顯升高。代謝物的水平在衣藻轉(zhuǎn)入低濃度CO2 30 min后升高，但24 h內(nèi)恢復(fù)至初始水平。一般認(rèn)為衣藻在適應(yīng)低CO2濃度時(shí)，光呼吸途徑中酶基因的表達(dá)、酶活性和代謝物水平的升高是暫時(shí)的，而后隨著CCM被誘導(dǎo)，均會(huì)恢復(fù)至初始的水平，CCM提高了Rubisco周圍的CO2濃度從而抑制了Rubisco加氧酶的活性，降低光呼吸。

盡管認(rèn)為光呼吸是衣藻對(duì)外界低CO2濃度時(shí)調(diào)節(jié)碳代謝的重要機(jī)制，但許多其他的碳代謝途徑如淀粉代謝、糖酵解或脂代謝、呼吸作用中碳代謝均與光合作用過程中碳代謝密切相連，這些代謝與其他營(yíng)養(yǎng)成分的代謝如氮、硫、磷和金屬元素的吸收使得藻類能快速適應(yīng)多變的環(huán)境進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，闡明這個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系將是未來研究的方向。

4 衣藻CCM轉(zhuǎn)入高等植物的研究

為了滿足不斷增長(zhǎng)的全球人口的物質(zhì)需求，到2050年糧食產(chǎn)量要提高85%以上。僅通過傳統(tǒng)農(nóng)作物選育的方法或者農(nóng)田擴(kuò)展的方法，這個(gè)目標(biāo)產(chǎn)量是不可能實(shí)現(xiàn)的。已經(jīng)證實(shí)的一個(gè)可行的方法是通過遺傳工程提高作物的光合效率。光合作用中限制CO2固定的重要因素是Rubisco酶的催化效率低。為了減少光呼吸，一些光合產(chǎn)物會(huì)通過CCMs提高Rubisco活性位點(diǎn)周圍CO2/O2比率。有模型表明，如果將CCM成功引入主要糧食作物如水稻、小麥和大豆，可以使碳固定提高60%，同時(shí)還能提高水和氮的利用率[46]。許多CCM和光合作用工程的策略正在繼續(xù)研究，最有前景的是將衣藻的CCM轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中以提高農(nóng)作物的光合效率。為了提高Rubisco周圍的CO2濃度，目前正在進(jìn)行衣藻CCM蛋白核和HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體的改造、藍(lán)細(xì)菌CCM羧酶體和無機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)體的改造、Rubisco蛋白動(dòng)力學(xué)的改造、光呼吸中基因的改造以及優(yōu)化卡爾文循環(huán)中RuBP的再生等[47]。

為了將衣藻的CCM引入高等植物，需要系統(tǒng)完整的分析方法。前期的工作已經(jīng)取得了重大的進(jìn)展，如已將藍(lán)細(xì)菌的Rubisco轉(zhuǎn)化入煙草質(zhì)體中以改造C3植物[48];藍(lán)細(xì)菌中的HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BicA也成功地在煙草的質(zhì)體中表達(dá)[49];衣藻CCM蛋白HLA3、LCIA和LCIB成功在高等植物中表達(dá)，衣藻的Rubisco成功引入擬南芥中并能在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)[50];在大腸桿菌中功能性組裝完成了卡爾文循環(huán)[51]等。如果要鑒定高等植物中CCM的核心成分，可以將CCM引入到一個(gè)異源的、生長(zhǎng)迅速、無CCM的光合系統(tǒng)中，如苔蘚（小立碗蘚）、地錢、植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或者不含CCM的綠藻中。人工建造一套有功能的CCM的核心成分對(duì)于指導(dǎo)植物基因工程有重要作用。

未來研究CCM功能可以通過雜交系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，CCM成分可取自多種來源的物種，如綠藻、藍(lán)藻、硅藻、定鞭藻類和角苔。另外，還可通過合成蛋白質(zhì)執(zhí)行特定功能，如合成Rubisco連接體用于匹配連接高等植物的Rubisco，合成一種嵌合蛋白用于多種成分的正確組裝[52]。

5 總結(jié)與展望

衣藻CCM可以增加Rubisco周圍的CO2濃度，從而增強(qiáng)光合效率。衣藻CCM中除了典型的Ci吸收系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HLA3、LCIA和CAs外，衣藻內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了許多新的Ci吸收系統(tǒng)，包括LCIB/LCIC、LCI1和未被描述的蛋白，這些蛋白均是受限CO2濃度下誘導(dǎo)表達(dá)的。對(duì)這些蛋白的分子功能及其他Ci吸收系統(tǒng)進(jìn)行研究，不僅可以更好地理解CCM，還可以提供一套完整的方案提高藻類和高等植物獲取Ci的效率。目前實(shí)驗(yàn)室正在研究喀斯特水體中綠藻的CCM與非喀斯特水體中綠藻的CCM的不同，以期能為更深入地理解CCM補(bǔ)充數(shù)據(jù)支持。

因?yàn)檎婧嗽孱惡透叩染S管植物進(jìn)化上有比較近的親緣關(guān)系、相似的光合作用，所以真核藻類的CCM可能有更大的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)入高等植物。未來迫切需要一個(gè)模型用來指導(dǎo)將衣藻的成分轉(zhuǎn)化到高等植物中。將衣藻CCM或者雜交CCM引入C3植物將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，但是正確利用資源一定能將其變成現(xiàn)實(shí)。

因?yàn)樗h(huán)境的復(fù)雜多變，以衣藻為模式生物對(duì)CCM的許多研究還不是很系統(tǒng)。從細(xì)胞水平和分子水平上對(duì)藍(lán)細(xì)菌和真核微藻CCM機(jī)制更詳盡的研究以及準(zhǔn)確將CCM引入高等植物以提高高等植物的光合作用效率將是未來的研究方向。

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