• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中性脂含量高的微擬球藻藻株的快速篩選?

    2023-11-25 13:45:08陳小凡王路路肖騰飛朱葆華潘克厚
    關(guān)鍵詞:藻株球藻微藻

    陳小凡, 王路路, 肖騰飛, 朱葆華, 李 赟, 潘克厚,2??

    (1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實驗室(中國海洋大學(xué)), 山東 青島 266003; 2. 嶗山實驗室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 山東 青島 266237)

    海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)微擬球藻藻屬(Nannochloropsis)[1],是一種海洋單細(xì)胞微藻,具有生長速度快,油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)[2]。微藻體內(nèi)油脂主要由中性脂與極性脂組成,中性脂是微藻碳和能量的儲存形式,被認(rèn)為是生物柴油的理想來源[3]。微擬球藻脂質(zhì)含量占干質(zhì)量的39.4%~44.9%[4]是微藻生物柴油生產(chǎn)的模式藻株。

    在對已有的微擬球藻藻株進(jìn)行比較基礎(chǔ)上,開展誘變選育是獲得高油脂產(chǎn)率藻株的重要途徑。目前優(yōu)良微藻藻株的育種方法包括誘變育種和轉(zhuǎn)基因育種。微藻的誘變育種包括物理法(如紫外線、射線、等離子體和重離子束等)和化學(xué)法(如甲烷磺酸乙酯(EMS)亞硝基胍(NTG)等)[5-6]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)則是將油脂合成的功能基因轉(zhuǎn)入微藻體內(nèi)以定向改變油脂的積累能力。誘變是不定向的,轉(zhuǎn)基因也需要考慮轉(zhuǎn)基因藻株的最終生物學(xué)功能,故在誘變和轉(zhuǎn)基因后,都需要對獲得的藻株進(jìn)行快速篩選。尼羅紅染色熒光強(qiáng)度與中性脂質(zhì)密切相關(guān)[7],利用尼羅紅染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析是目前快速篩選高油脂含量微藻的有效方法,這一方法已廣泛用于硅藻、金藻、褐藻和綠藻等微藻油脂含量的分析[8]。

    微藻的油脂產(chǎn)率由微藻的生長速率和微藻的中性脂含量共同決定,因此篩選優(yōu)良的藻株時需要同時考慮這兩個因素。利用轉(zhuǎn)基因方法、化學(xué)和物理誘變方法,本實驗室獲得了75株微擬球藻變異藻株。為評價這些變異藻株的油脂生產(chǎn)潛力,使用尼羅紅染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析藻株的中性脂含量,同時考慮藻株的生物量,綜合比較了藻株的油脂生產(chǎn)性能,以期為這些藻株的生產(chǎn)應(yīng)用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料及培養(yǎng)方法

    本實驗所用微擬球藻誘變藻株均來自野生藻株085,其中基因過表達(dá)藻株12株[9],分別為Δ6去飽和酶基因(NoD6)3株、Δ12去飽和酶基因(NoD12)3株,以及2條來自三角褐指藻1條來自擬南芥的二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶DGAT基因,命名為PtDGAT1(2株)、PtDGAT2(3株)和AtDGAT(1株)。28株物理誘變藻株均為常壓室溫等離子(ARTP)誘變[10]。33株化學(xué)誘變藻株分別為博來霉素誘變5株[11],甲基磺酸乙酯(EMS)誘變7株[12],亞硝基胍(NTG)誘變18株[13-14]。另外還有Sandoz9785抗性篩選藻株3株[15]和煙氣馴化實驗1株。所有藻種均保存在中國海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)實驗室微藻種質(zhì)庫,保存條件為 (17±1) ℃,光照強(qiáng)度35~45 μmol·m-2·s-1,光暗周期10 h∶14 h,每6個月轉(zhuǎn)接1次。

    為活化保存藻株用于實驗,對藻種進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),培養(yǎng)基為f/2海水培養(yǎng)基,鹽度30±2,光照強(qiáng)度為50~60 μmol·m-2·s-1,溫度為(25±3) ℃,每天定時搖瓶3次,培養(yǎng)至指數(shù)生長期用于后續(xù)實驗。

    1.2 藻株中性脂含量的檢測

    尼羅紅是一種脂溶性熒光染料,其在特定波長下熒光強(qiáng)度與油脂含量呈顯著的線性關(guān)系[16],可用于表征微藻的中性脂含量,其相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998[17]。

    本實驗所用的流式細(xì)胞儀型號為Beckman Coulter FC500,氬離子激光器激發(fā)波長為488 nm,尼羅紅發(fā)射波長為617 nm。分析軟件為CXP Analysis,選擇使用FL3通道。因微藻體內(nèi)自有色素干擾實驗結(jié)果,故在測定時先測定無染色藻株的自發(fā)熒光作為背底,后測量染色細(xì)胞熒光數(shù)值,去背底得到最終結(jié)果。每次測量時3個平行樣品均取1萬個細(xì)胞,共同計算表征樣品熒光強(qiáng)度。

    具體操作為取培養(yǎng)至平臺期的微擬球藻藻液2 mL于離心管中,6 000 r/min離心5 min,去上清,加入過濾后的海水進(jìn)行吹打清洗后再次離心,重復(fù)2次,棄上清,保留藻細(xì)胞。加入用海水稀釋過的體積分?jǐn)?shù)為25%的DMSO溶液0.5 mL,充分震蕩后室溫避光靜置10 min[8]。為確定尼羅紅濃度和染色時間,保持其他條件不變,設(shè)定不同濃度的尼羅紅染料對微擬球藻進(jìn)行染色處理:0,0.1, 0.3,0.5,1和5 mg/mL。在不同染色濃度的基礎(chǔ)上設(shè)定了兩組染色時間為10與30 min。每組實驗重復(fù)3次,取平均值用于分析。

    1.3 藻株培養(yǎng)過程中中性脂含量分析

    為確定微藻中性脂含量測定的時間,選取野生藻株與ARTP誘變藻株194進(jìn)行比較實驗。

    兩株藻接種后藻液(75 mL)光密度值(OD)均為0.1,在100 mL的錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件同預(yù)培養(yǎng),每株藻均做3個重復(fù)。培養(yǎng)過程中,每天定時取2 mL藻液通過分光光度計(Hitachi U-3310)測定其在680 nm波長下的OD值[18],以1 mL蒸餾水進(jìn)行調(diào)零。培養(yǎng)周期為12 d。

    分別取培養(yǎng)第1,3,5,7,9,11,13天的藻液2 mL,如1.2所述步驟進(jìn)行洗滌染色,采用優(yōu)化后的染色條件,尼羅紅濃度為1 mg/mL,染色時間為10 min,利用流式細(xì)胞儀測定中性脂的相對含量。

    1.4 藻株生物量和中性脂產(chǎn)率的測定

    取10 mL藻液于離心管中,用烘干至恒重的GF/C玻璃纖維素膜(直徑47 mm,孔徑0.45 μm)抽濾藻液,濾膜放入恒溫箱中60 ℃烘干至恒重后,稱量過濾后生物膜的質(zhì)量,減去生物膜的質(zhì)量,計算生物量。

    以原始藻株作為標(biāo)準(zhǔn),將變異藻株與原始藻株的生物量之比作為生物量提升的指標(biāo),同理將變異藻株與原始藻株的熒光強(qiáng)度之比作為中性脂提升的指標(biāo),二者乘積為變異藻株的相對中性脂產(chǎn)率,用于表征其產(chǎn)油能力的水平[19]。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    本文所涉及實驗均設(shè)置3個平行,數(shù)據(jù)采用軟件SPSS25.0進(jìn)行單因素方差分析,事后分析為圖基(HSD)檢驗,顯著性水平P<0.05,采用Origin Pro 2018繪圖。

    2 結(jié)果分析

    2.1 微擬球藻尼羅紅染色方法優(yōu)化

    尼羅紅染色后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。結(jié)果顯示(見圖1),微藻熒光強(qiáng)度受染尼羅紅染色時間和濃度共同影響,尼羅紅濃度較染色時間對熒光強(qiáng)度影響更顯著。染色10 min處理組中,熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有所上升,染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)1 mg/mL處理組與5 mg/mL處理組差別不顯著。此外,染色30 min處理組中,當(dāng)濃度為0.1~1 mg/mL時,隨著尼羅紅濃度的增加,熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均有所上升,但高濃度長時間處理會影響細(xì)胞活性,導(dǎo)致5 mg/mL處理組熒光強(qiáng)度與染色細(xì)胞數(shù)均下降。綜合兩方面的結(jié)果,濃度1 mg/mL的尼羅紅染色10 min比較理想。

    (a,b表示方差分析差異程度,同一圖中有相同字母的組之間差異不顯著(P>0. 05)。 a、b represents the analysis of variance difference. Values in the same picture with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).)

    2.2 藻株生長及中性脂含量測定時間的確定

    用OD值表征微藻的生長情況,結(jié)果顯示(見圖2(A)),兩株微擬球藻的生長周期無顯著差異。在經(jīng)過2 d的適應(yīng)后,藻株進(jìn)入指數(shù)生長期,藻細(xì)胞密度快速增長。在第6天進(jìn)入平臺期,生長放緩,生物量趨于穩(wěn)定緩慢上升。隨著微藻生長,藻細(xì)胞脂質(zhì)含量經(jīng)過一個先升高后降低并逐漸穩(wěn)定的過程(見圖2(B))。藻株085中性脂在第3天達(dá)到最高,第7天后趨于穩(wěn)定。藻株194總體中性脂含量高于085,其脂質(zhì)含量在第1天達(dá)到頂峰后產(chǎn)生波動,在第7天趨于穩(wěn)定。由于第1天和第3天微藻處于指數(shù)生長期,生物量較低,第9天其生物量與油脂含量較高且處于穩(wěn)定狀態(tài),同時考慮微藻生長與油脂積累,選擇微藻培養(yǎng)至第9天為測量藻株油脂積累量的時間。

    圖2 原始藻株085與誘變藻株194培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度(A)和熒光強(qiáng)度(B)的變化

    2.3 微擬球藻藻株的篩選比較

    2.3.1 變異微藻的油脂產(chǎn)率分析 以原始藻株085作為對照,分析實驗藻株中性脂含量和生物量的增長情況,結(jié)果顯示(見表1),除藻株104和198之外,其余實驗藻株生物量均大于原始藻株,藻株183生物量提升幅度最大,為原始藻株的57.5%。除藻株229和191外,其余實驗藻株中性脂含量均大于原始藻株,藻株183中性脂提升幅度最大,為原始藻株的154.9%。綜合比較藻株中性脂的產(chǎn)率,結(jié)果顯示,所有實驗藻株的相對產(chǎn)率均大于原始藻株,其中藻株231相對產(chǎn)率提升幅度最大,為原始藻株的223.8%。

    表1 75株微擬球藻生物量與中性脂相對含量

    進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),藻株192的生物量明顯高于原始藻株(原始藻株的154.6%),但脂質(zhì)含量未見顯著提升(僅為原始藻株的119.80%),其油脂相對產(chǎn)率并不優(yōu)異(僅為原始藻株的185.2%)。而藻株232脂質(zhì)含量高于原始藻株(為原始藻株的146.50%),但生物量未見顯著提升(為原始藻株117.4%),其相對產(chǎn)率也不突出(僅為原始藻株的172.0%)。這說明,微藻的脂質(zhì)產(chǎn)率受到兩方面的影響,一是生物量,二是油脂含量,在高油脂微藻藻株篩選過程中不僅要考慮藻株的脂質(zhì)含量,也要考慮藻株的生物量生產(chǎn)能力。

    2.3.2 不同育種技術(shù)提高油脂產(chǎn)率的效果分析 以油脂相對產(chǎn)率提升到210%做為優(yōu)良藻株的篩選指標(biāo),轉(zhuǎn)基因誘變藻株中,5株轉(zhuǎn)基因藻株中性脂相對產(chǎn)率均高于210%,其中088號藻株相對產(chǎn)率最高,為252.2%。ARTP誘變藻株中,有6株相對產(chǎn)率高于210%,其中182號藻株相對產(chǎn)率最高,為244.6%。EMS誘變藻株中,有3株相對產(chǎn)率高于210%,其中101號藻株相對產(chǎn)率最高,為259.0%。博萊霉素誘變藻株,僅212號藻株相對產(chǎn)率高于210%,為247.8%。NTG誘變藻株中,有4株相對產(chǎn)率高于210%,231號藻株相對產(chǎn)率最高,為323.8%。另外,除草劑Sandoz9785篩選的3株藻株中,252號藻株相對產(chǎn)率最高,為196.8%,煙氣馴化藻株相對產(chǎn)率較低,僅為126.5%。上述結(jié)果表明,不同育種技術(shù)用于微擬球藻高油脂產(chǎn)率的培育存在明顯不同,其中231號、088號和101號藻株表現(xiàn)格外突出,其油脂相對產(chǎn)率均高于250%,有望應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

    3 討論

    微藻中性脂傳統(tǒng)的測定步驟包括溶劑萃取、薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)等,其操作繁瑣,費(fèi)時費(fèi)力,難以實現(xiàn)對誘變藻株的快速篩選[17]。尼羅紅(NR-9-二乙氨基-5-苯并[α]苯并惡嗪酮)是一種脂溶性熒光染料,Cooksey等在1987年發(fā)現(xiàn),尼羅紅可與細(xì)胞內(nèi)的中性脂結(jié)合,產(chǎn)生黃金色熒光,熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)結(jié)合中性脂的量密切相關(guān),可作為微藻中性脂含量檢測的方法[20]。2010年Doan等[21]將改良的尼羅紅染色法運(yùn)用到微擬球藻中性脂含量的分析之中并取得良好效果。2016年Alemán-Nava等[8]在前人的研究基礎(chǔ)上制定了不同微藻尼羅紅脂質(zhì)測定的規(guī)范方法,該方法涉及脂質(zhì)測定所必須遵循的五個步驟,本實驗基于該方法開展了實驗藻株中性脂含量的分析。

    誘變和基因工程是促進(jìn)微藻脂質(zhì)合成的兩種策略?;蚬こ炭梢园凑赵O(shè)計者意愿直接改變油脂合成路徑中的關(guān)鍵酶基因[22]。二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶(DGAT)作用于TAG生物合成路徑中的最后一步,催化二酰甘油和游離?;o酶A縮合反應(yīng)生成三酰甘油即TAG,此外Δ6去飽和酶與Δ12去飽和酶位于PUFA合成路徑中,與油脂合成相關(guān)。結(jié)果顯示,改變以上基因均有效地提高了微擬球藻的中性脂含量,因未改變生長過程相關(guān)基因,故其生物量并未出現(xiàn)顯著變化。5株轉(zhuǎn)基因藻株中性脂產(chǎn)率均高于210%,說明轉(zhuǎn)入目標(biāo)功能基因可大幅度提高微藻產(chǎn)油能力,但同時也可看到,本實驗轉(zhuǎn)基因藻株中性脂產(chǎn)率并不是最高的,說明進(jìn)一步篩選油脂合成基因以及促進(jìn)生長基因?qū)τ谔岣呶M球藻的油脂產(chǎn)率還是很有必要的。目前微擬球藻的全基因組測序工作已經(jīng)全部完成[9],基因的注釋工作還在繼續(xù),這為獲得以上兩方面優(yōu)良基因提供了可能。

    微藻常壓室溫等離子體誘變(ARTP)是一種基于射頻和大氣壓離子體射流的物理誘變技術(shù)。Cao等[23]于2017年利用ARTP誘變獲得了一株蛋白核小球藻的突變體,與對照組相比,其OD680增加了32.08%,干質(zhì)量和產(chǎn)脂量分別增加了22.07%和16.85%。Sun等[24]利用ARTP誘變并定向篩選丙二酸(MA)抗性藻株,獲得了高脂產(chǎn)率柵藻誘變株,其總脂含量比對照組高114.99%。本文28株微擬球藻ARTP誘變藻株中,有15株中性脂相對含量有顯著提升,最高增加了105.8%,有5株生物量有顯著提升,最高提升了60.9%,這說明ARTP誘變不僅可以提升藻株油脂含量也可以提升藻株生長。

    甲基磺酸乙酯(EMS)和亞硝基胍(NTG)均屬于烷化劑,其誘變機(jī)理為其活潑烷基與DNA分子中的氫原子發(fā)生烷化反應(yīng),引起堿基錯配從而導(dǎo)致微藻的相關(guān)基因發(fā)生改變。Anandarajah等[6]使用EMS處理微擬球藻,與野生型相比,誘變藻株的總脂生產(chǎn)能力提高了25.7%。本實驗的7株EMS誘變藻株,其中性脂相對含量均有顯著提升,但僅有1株生物量有明顯改變。Chou等[25]利用NTG誘變獲得了一批耐熱小球藻誘變株,其不僅可在40 ℃高溫下生長還顯示出比野生型更高的糖類和脂類含量。本實驗18株NTG誘變藻株中,其中11株藻的中性脂相對含量有明顯的改變,但所有誘變藻株生物量未發(fā)生顯著改變,如誘變藻株231,盡管其油脂產(chǎn)率為原始藻株的323.8%,是實驗藻株中油脂產(chǎn)率最高的,這主要是該藻株油脂積累能力比原始藻株高147.3%,而生物量僅提升了29.0%。這說明這類誘變劑可能更適用于微藻油脂含量的提升。

    博萊霉素是一種來自放線菌的糖肽類抗腫瘤抗生素,其可與鐵的復(fù)合物嵌入 DNA 中,導(dǎo)致 DNA 單鏈和雙鏈斷裂。張琳等[26]選取了5種抗生素對微擬球藻的抗生素抗性進(jìn)行了比較,結(jié)果顯示,微擬球藻對博萊霉素表現(xiàn)出高度敏感性。在固體培養(yǎng)中, 0.5 μg/mL的博來霉素即可完全抑制微擬球藻的生長。博萊霉素用于誘變微藻目前報道不多,本研究博來霉素誘變藻株中,藻株212號,生物量比原始藻株提高了49.8%,中性脂含量提高了65.5%,最終油脂產(chǎn)率提高了147.8%,說明博萊霉素不僅可以提高微擬球藻的油脂生產(chǎn),也可以提高生物量的積累能力。

    4 結(jié)語

    本研究利用尼羅紅染色結(jié)合流式細(xì)胞儀對75株微擬球藻進(jìn)行了高通量篩選,結(jié)果顯示該方法是一種方便快速的篩選方式?;谟椭a(chǎn)率是原始藻株250%這一選擇指標(biāo),本實驗75株藻株中,有3株表現(xiàn)突出,有望應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)。

    猜你喜歡
    藻株球藻微藻
    黃河口灘涂翼內(nèi)繭型藻的分離鑒定及鹽度適應(yīng)性分析*
    真菌Simplicillium lanosoniveum DT06 對雨生紅球藻生長與脂類合成的影響
    可再生能源(2022年8期)2022-08-17 06:37:52
    代食品運(yùn)動中微藻的科研與生產(chǎn)
    基于提高乙醇產(chǎn)率的常壓室溫等離子體微藻誘變育種
    長心卡帕藻兩種顏色藻株的生長差異研究
    小球藻的沼液馴化、抗生素敏感性分析和選擇標(biāo)記篩選
    球藻沉浮的秘密植物
    大自然探索(2019年2期)2019-03-01 02:23:30
    聚球藻硅質(zhì)化作用初探
    絮凝法采收生物燃料微藻的研究進(jìn)展
    反相高效液相色譜法檢測鯽魚組織中的節(jié)球藻毒素
    日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩黄片免| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久久久久久久中文| 好男人在线观看高清免费视频 | 宅男免费午夜| 亚洲精品在线观看二区| 中文字幕高清在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 国产免费av片在线观看野外av| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产激情欧美一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美成人性av电影在线观看| 两性夫妻黄色片| 欧美色视频一区免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品日产1卡2卡| 一本精品99久久精品77| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜福利在线在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久久精品欧美日韩精品| 人成视频在线观看免费观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久青草综合色| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产一区二区三区视频了| 国产av在哪里看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 在线国产一区二区在线| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜影院日韩av| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美黑人巨大hd| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产区一区二久久| 午夜免费鲁丝| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 黄色丝袜av网址大全| 中文字幕久久专区| 岛国在线观看网站| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲第一青青草原| 亚洲人成77777在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 美女大奶头视频| 亚洲 国产 在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 成人精品一区二区免费| 亚洲三区欧美一区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 校园春色视频在线观看| 无限看片的www在线观看| ponron亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美zozozo另类| 国产欧美日韩一区二区精品| 人人澡人人妻人| 不卡av一区二区三区| 黄色 视频免费看| 亚洲第一av免费看| 久久中文字幕人妻熟女| 好男人在线观看高清免费视频 | 成人国产一区最新在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精华一区二区三区| 国产真实乱freesex| 99热这里只有精品一区 | 99久久99久久久精品蜜桃| 国产亚洲精品av在线| 在线观看66精品国产| 日本五十路高清| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美zozozo另类| 精品无人区乱码1区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品电影一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 麻豆一二三区av精品| 久热爱精品视频在线9| 亚洲 国产 在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 精品日产1卡2卡| 精品国产国语对白av| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产视频内射| 国产v大片淫在线免费观看| 女警被强在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲三区欧美一区| 1024香蕉在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美色欧美亚洲另类二区| 91老司机精品| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 成人亚洲精品av一区二区| 欧美黑人巨大hd| 久久精品91无色码中文字幕| 久久狼人影院| 99久久99久久久精品蜜桃| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线av久久热| 少妇的丰满在线观看| 在线看三级毛片| 免费在线观看成人毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频| 香蕉丝袜av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 18禁国产床啪视频网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 免费观看人在逋| 日日干狠狠操夜夜爽| 中国美女看黄片| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看日韩欧美| 国产麻豆成人av免费视频| 狂野欧美激情性xxxx| 观看免费一级毛片| 亚洲国产精品合色在线| 久久久国产欧美日韩av| 久久中文字幕一级| 欧美在线一区亚洲| 91麻豆av在线| 精品国产国语对白av| 午夜视频精品福利| 身体一侧抽搐| 亚洲第一青青草原| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久久久久久久免费视频| 动漫黄色视频在线观看| www.999成人在线观看| 亚洲黑人精品在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美日韩黄片免| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲五月天丁香| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 嫁个100分男人电影在线观看| 久9热在线精品视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产av一区在线观看免费| 男女那种视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| www日本在线高清视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜免费鲁丝| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利在线观看吧| 久久久久久久午夜电影| 午夜a级毛片| 成人av一区二区三区在线看| 色综合婷婷激情| 国产av一区在线观看免费| 午夜激情福利司机影院| 精品免费久久久久久久清纯| 啦啦啦韩国在线观看视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 又大又爽又粗| 夜夜夜夜夜久久久久| 色播在线永久视频| 男人舔女人的私密视频| 免费高清在线观看日韩| 亚洲成人久久爱视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美日韩精品网址| 国产一区在线观看成人免费| 久久精品91无色码中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产三级黄色录像| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久久午夜电影| 两人在一起打扑克的视频| 成人精品一区二区免费| 一区二区三区高清视频在线| 天堂动漫精品| 黄片大片在线免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 在线观看免费午夜福利视频| 国产日本99.免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av福利片在线| 日本一区二区免费在线视频| 午夜久久久久精精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精品av麻豆狂野| 超碰成人久久| 日韩免费av在线播放| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产不卡一卡二| а√天堂www在线а√下载| aaaaa片日本免费| 国产亚洲精品av在线| 999久久久精品免费观看国产| 在线视频色国产色| 日韩精品免费视频一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美黑人精品巨大| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产日本99.免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 高清在线国产一区| 中文字幕高清在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品1区2区在线观看.| 国产成人欧美| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 看免费av毛片| 91字幕亚洲| 天堂√8在线中文| av福利片在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美在线一区亚洲| 午夜免费鲁丝| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精华霜和精华液先用哪个| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 这个男人来自地球电影免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 悠悠久久av| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品无人区乱码1区二区| 国产伦一二天堂av在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 色播亚洲综合网| 日韩欧美国产在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 狠狠狠狠99中文字幕| svipshipincom国产片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费高清视频大片| 后天国语完整版免费观看| 看片在线看免费视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 最新美女视频免费是黄的| 99久久久亚洲精品蜜臀av| www.999成人在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 天天一区二区日本电影三级| 长腿黑丝高跟| 欧美黄色淫秽网站| 久热爱精品视频在线9| АⅤ资源中文在线天堂| e午夜精品久久久久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 免费av毛片视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 日本在线视频免费播放| 黑人操中国人逼视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av电影在线进入| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一区二区三区高清视频在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美三级亚洲精品| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 国产主播在线观看一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲色图av天堂| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 日韩大码丰满熟妇| 欧美久久黑人一区二区| 午夜视频精品福利| 国产成人精品无人区| 午夜久久久久精精品| 999久久久国产精品视频| 黄片小视频在线播放| 在线观看免费午夜福利视频| 国产高清videossex| 久久婷婷成人综合色麻豆| 91av网站免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 欧美日韩精品网址| 国产精品二区激情视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲国产精品合色在线| 国产三级在线视频| 黄色视频,在线免费观看| 久99久视频精品免费| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 无人区码免费观看不卡| 免费在线观看日本一区| 男人舔女人的私密视频| 99在线人妻在线中文字幕| 十八禁人妻一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产片内射在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 激情在线观看视频在线高清| 黄色 视频免费看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 狂野欧美激情性xxxx| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 免费在线观看成人毛片| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 亚洲自拍偷在线| 人人妻人人澡人人看| 日韩欧美 国产精品| 制服诱惑二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 香蕉国产在线看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精华一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 两性夫妻黄色片| 欧美三级亚洲精品| 1024手机看黄色片| 午夜福利高清视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人国产一区最新在线观看| 国产视频内射| 久久人人精品亚洲av| 99热6这里只有精品| 韩国精品一区二区三区| e午夜精品久久久久久久| av天堂在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美精品综合久久99| 色在线成人网| 午夜福利成人在线免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 一本精品99久久精品77| 天堂动漫精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 波多野结衣高清作品| 精品第一国产精品| 国产av不卡久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 天天添夜夜摸| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲黑人精品在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产区一区二久久| 国产一区在线观看成人免费| 国产久久久一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 黄色丝袜av网址大全| 久久天堂一区二区三区四区| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产成年人精品一区二区| 两个人看的免费小视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日日夜夜操网爽| 欧美性猛交黑人性爽| 精品国产国语对白av| 精品国产乱码久久久久久男人| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 美女国产高潮福利片在线看| 老鸭窝网址在线观看| 一级黄色大片毛片| tocl精华| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 色在线成人网| 女警被强在线播放| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 久久久国产成人免费| 99国产综合亚洲精品| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品一区二区三区四区久久 | 久久人妻av系列| 青草久久国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 一本综合久久免费| 国产精品影院久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 女警被强在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 搡老岳熟女国产| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 日韩欧美三级三区| 免费在线观看亚洲国产| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久人人人人人| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲国产精品sss在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲,欧美精品.| 日日夜夜操网爽| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲专区字幕在线| 午夜福利在线观看吧| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美日韩福利视频一区二区| 男人舔奶头视频| 可以在线观看的亚洲视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩av在线大香蕉| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| www国产在线视频色| 不卡一级毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 淫妇啪啪啪对白视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品亚洲av一区麻豆| 999久久久精品免费观看国产| 69av精品久久久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 草草在线视频免费看| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品不卡国产一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 成人一区二区视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久精品91蜜桃| 国产成人精品久久二区二区91| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99热只有精品国产| 男男h啪啪无遮挡| 51午夜福利影视在线观看| 国产黄片美女视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美三级三区| 91在线观看av| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线观看www视频免费| 可以在线观看的亚洲视频| 美女大奶头视频| 中文字幕最新亚洲高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 伦理电影免费视频| videosex国产| 欧美日韩精品网址| 后天国语完整版免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品国产国语对白av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 身体一侧抽搐| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品,欧美在线| 中文字幕av电影在线播放| 18禁美女被吸乳视频| 又紧又爽又黄一区二区| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲第一av免费看| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲九九香蕉| 亚洲三区欧美一区| 两人在一起打扑克的视频| 国产免费av片在线观看野外av| 成人欧美大片| 69av精品久久久久久| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产亚洲精品av在线| 1024视频免费在线观看| 男人舔奶头视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲精品美女久久av网站| 99国产精品一区二区三区| 青草久久国产| 亚洲欧美日韩无卡精品| 黄片播放在线免费| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 少妇 在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 99久久综合精品五月天人人| 十八禁网站免费在线| 一本综合久久免费| 两性夫妻黄色片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜免费鲁丝| 国产成人精品久久二区二区91| 老司机靠b影院| 精品日产1卡2卡| 哪里可以看免费的av片| 成人国产综合亚洲| 久9热在线精品视频| 国产一区在线观看成人免费| 成人一区二区视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 18禁观看日本| 亚洲第一电影网av| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲三区欧美一区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 深夜精品福利| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲国产欧美网| 一本久久中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 性色av乱码一区二区三区2| 老汉色∧v一级毛片| 人妻久久中文字幕网| 国产精品九九99| 白带黄色成豆腐渣| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 丰满的人妻完整版| 一本综合久久免费| 欧美色视频一区免费| 男女下面进入的视频免费午夜 | 欧美黄色片欧美黄色片| 一本综合久久免费| 好男人在线观看高清免费视频 | 看免费av毛片| 国产高清有码在线观看视频 | 日本成人三级电影网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 999久久久国产精品视频| e午夜精品久久久久久久| 91成人精品电影| 亚洲免费av在线视频| av在线播放免费不卡| 国产精品永久免费网站| 亚洲第一青青草原| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲性夜色夜夜综合| 超碰成人久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 无人区码免费观看不卡| 国产成人系列免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩欧美免费精品| 欧美精品亚洲一区二区| 香蕉国产在线看| 国产精品影院久久| 成人三级做爰电影| 亚洲,欧美精品.| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 欧美日本视频| 男女之事视频高清在线观看| 精品不卡国产一区二区三区|