HPLC法測(cè)定復(fù)方參龍膠囊中5個(gè)功效成分的含量

高亞亞,柴旭兵,閆 俊,葉 楠,曹團(tuán)平,楊 瑩,封 婷

(1西安市第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,西安 710082;2榆林市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:fengting1126@126.com)

腦梗死是一種臨床中常見的腦血管疾病,主要是由于腦血管血栓形成導(dǎo)致腦組織供血供氧不足引起的[1],具有高致殘率、高致死率的特點(diǎn)。一般臨床中將其分三種類型即腦血栓、腔隙性梗死、腦栓塞,該疾病由于起病急、發(fā)展快,在短時(shí)間內(nèi)可造成腦組織壞死或軟化,其預(yù)后較差,存在偏癱、失語(yǔ)等多種并發(fā)癥[2-4]。目前由于人們生活方式變化,不注重飲食習(xí)慣,其發(fā)病率越來(lái)越高,發(fā)病率約占血管性癡呆總發(fā)病率的8%-12%[5-7]。在臨床治療上,采用常規(guī)治療方式盡管在早期能夠?qū)崿F(xiàn)溶栓,減少神經(jīng)功能損傷,但臨床中所收治的患者多數(shù)錯(cuò)過了溶栓時(shí)間窗,再進(jìn)行常規(guī)治療的效果不甚理想。所以亟需尋找理想治療方法,中藥為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥,能通過多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)對(duì)疾病進(jìn)行全面治療[8]。復(fù)方參龍膠囊為本院臨床運(yùn)用多年的院內(nèi)制劑,由西洋參、三七、黃芪、遠(yuǎn)志、當(dāng)歸等組成,治療腦梗死臨床療效反應(yīng)良好。因此,筆者采用高效液相色譜法檢測(cè)該制劑主要功效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd,為該制劑建立質(zhì)量控制方法,亦為該制劑的動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究奠定了基礎(chǔ);同時(shí)功效成分的檢出與定量亦為臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(Prominence LC-2030,帶自動(dòng)進(jìn)樣器,LC/Labsoluion色譜工作站),日本島津公司;Shim-pack VP-ODS液相色譜柱:Intersil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,島津技邇上海商貿(mào)有限公司經(jīng));ME235S型電子分析天平,德國(guó)塞多利斯公司;KQ-5200DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器,昆山超聲儀器有限公司。對(duì)照品:三七皂苷R1(批號(hào):110745-201921,含量90.4%)、人參皂苷Rg1(批號(hào):110703-201933,含量93.4%)、人參皂苷Re(批號(hào):110754-202028,含量以93.9%)、人參皂苷Rb1(批號(hào):110704-202028,含量93.1%),人參皂苷Rd(批號(hào):111818-201603,含量92.1%),均購(gòu)自中國(guó)藥品食品檢定研究院;復(fù)方參龍膠囊(批號(hào)170108、170109、170110,規(guī)格0.4 g/粒)為西安市第五醫(yī)院藥劑科制備;超純水(由美國(guó)密理博純水儀制備,美國(guó)密理博公司);乙腈、甲醇均為HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司;其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液溶液(B),梯度洗脫見表1。記錄時(shí)間為100 min。體積流量:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;進(jìn)樣量:10 μl;理論板數(shù)按人參皂昔Rb1峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000[9]。

表1 梯度洗脫表

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取三七皂苷R1 5.00 mg、人參皂苷Rg1 8.00 mg、人參皂苷Re 7.00 mg、人參皂苷Rb1 10.00 mg,人參皂苷Rd 6.50 mg置于10 ml量瓶中,加甲醇定溶至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取20粒本品,傾出內(nèi)容物,研細(xì),混勻,稱取粉末5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50 ml甲醇,稱定重量,放置過夜,超聲處理(功率250 W,頻50 kHz)30 min,放涼,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,靜置,再用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例,分別制備缺西洋參和三七模擬制劑,再分別按“2.2.3”項(xiàng)制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

分別精密量取混合對(duì)照品0.05,0.10,0.20,0.04,0.80,1.00 ml,分別置于各個(gè)1 ml的量瓶中,加甲醇定容至1 ml,分別得混對(duì)照品溶液1,2,3,4,5,6。進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積,考察對(duì)照品濃度(x)與峰面積(y)的線性關(guān)系,結(jié)果各種成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見表2)。

表2 對(duì)照品的線性方程及其濃度范圍

2.6 專屬性實(shí)驗(yàn)

按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣陰性對(duì)照溶液、供試品溶液、混合對(duì)照溶液,結(jié)果陰性對(duì)照均無(wú)干擾,見圖1。

1.三七皂苷R1;2.人參皂苷Rg1;3.人參皂苷Re;4.人參皂苷Rb1;5.人參皂苷Rd

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液4,連續(xù)測(cè)定6次,進(jìn)樣測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的RSD分別為0.82%,0.95%,0.89%,1.04%和1.01%,說明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

使用混合對(duì)照品溶液4,分別于0,2,4,8,12,24 h,進(jìn)樣測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的RSD值分別為1.03%,0.96%,0.97%,1.21%和1.12%,說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取樣品(批號(hào)170108)5 g,精密稱定,按上述2.3項(xiàng)供試品制備方法制備6份供試品溶液及按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的RSD值分別見表3,結(jié)果顯示儀器重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.10 加樣回收率

稱取樣品(批號(hào)170108)5 g,精密稱定,精密稱定6份,分別按表4添加對(duì)照品溶液,依據(jù)上述2.3項(xiàng)供試品制備方法與2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的平均回收率和RSD值見表4,結(jié)果顯示本方法回收率良好。

表4 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 (未完待續(xù))

2.11 樣品含量測(cè)定

按照供試品制備方法制備樣品溶液,按照上述檢測(cè)方法測(cè)定三批中試樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1,人參皂苷Rd的含量,結(jié)果見表5。

表5 三批復(fù)方參龍膠囊5種成分測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

3 討論

復(fù)方參龍膠囊由西洋參、三七、黃芪、遠(yuǎn)志、當(dāng)歸、菖蒲、熟地黃、川芎等中藥組成,經(jīng)醇提、減壓干燥、生藥粉入藥等工藝制成膠囊,具有益氣活血、醒腦開竅等作用。文獻(xiàn)報(bào)道黃芪、菖蒲、當(dāng)歸、川芎等,可抑制腦缺血再灌注損傷后的細(xì)胞壞死和凋亡、炎癥反應(yīng)等[10-12];遠(yuǎn)志有保護(hù)心腦血管、抗癡呆、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶等藥理活性[13]。三七含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等5種成分[14],西洋參含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等4種人參皂苷[9,15-18]。西洋參與三七均具有神經(jīng)保護(hù),抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)損傷修復(fù)等作用[19-24]。三七皂苷R1與人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd均有保護(hù)心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[25-28],因此,對(duì)制劑中功效成分三七皂苷R1與人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等分析與定量很有必要。

采用PDA檢測(cè)器對(duì)復(fù)方參龍膠囊樣品所測(cè)成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的紫外吸收曲線在200-400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在203 nm波長(zhǎng)處均具有最大吸收,同時(shí)依據(jù)各峰的面積值與分離度及文獻(xiàn)[9]報(bào)道結(jié)果,選擇203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由于該制劑為中藥復(fù)方,成分復(fù)雜,存在水溶性、脂溶性成分等極性差異,所以采用梯度洗脫的方法。選用不同品牌與規(guī)格的色譜柱如Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱、Kromasil C18(150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、Hypersil GOLD C18(150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、ZORBAX SB-C18150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,結(jié)果Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱較理想。比較了不同流動(dòng)相系統(tǒng)甲醇(乙腈)-水、乙腈(甲醇)-磷酸水溶液(0.05%,0.1%,0.5%,0.8%)、乙腈(甲醇)-醋酸水溶液(0.2%,0.6%,0.8%)、乙腈(甲醇)-甲酸水溶液(0.1%,0.2%,0.5%)。結(jié)果,流動(dòng)相系統(tǒng)以乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)為最佳,其圖譜上各個(gè)色譜峰的分離度與保留時(shí)間較符合要求,所以選乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)。對(duì)不同柱溫(26,30,36,40 ℃)與流速(0.6,0.8,1.0,1.2 ml/min)進(jìn)行比較,結(jié)果選擇便于控制的柱溫30 ℃,流速1.0 ml/min較為理想;色譜記錄時(shí)間在100 min之后,無(wú)色譜峰出現(xiàn)。因此,選記錄時(shí)間為100 min。

對(duì)供試品制備方法進(jìn)行了研究,由于本制劑采用共比例乙醇提取,而西洋參與三七為生藥粉入藥,同時(shí)比較了甲醇、水、50%甲醇作為溶劑,處理方法采用超聲(15,30,45,60 min,功率250 W,頻率50 kHz與100 kHz)與加熱回流(30,45,60 min);結(jié)果采用甲醇作為溶劑,超聲30 min,功率250 W,頻率50 kHz為宜。

專屬性研究,因三七含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等5種成分,西洋參含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等4種人參皂苷,所以選擇同時(shí)缺西洋參與三七制備模擬制劑。

綜上所述,建立了復(fù)方參龍膠囊成分的HPLC分析方法,測(cè)定了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的含量,該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定簡(jiǎn)便、回收率高,可作為本品的質(zhì)量控制方法,亦為該制劑的動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)功效成分的檢出與定量亦為臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。