高通量測序技術(shù)檢測早期自然流產(chǎn)組織染色體非整倍體及拷貝數(shù)變異的臨床意義

鄭蕓蕓,李 佳,萬陜寧,鄭 嬌,黨穎慧,張建芳,楊 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

自然流產(chǎn)(spontaneous abortion,SA)為婦產(chǎn)科常見疾病,在妊娠中的發(fā)生率為10%-15%[1],其中早期流產(chǎn)(孕6-12周)約占80%。自然流產(chǎn)的病因十分復(fù)雜,包括胚胎因素、免疫因素、母體因素、環(huán)境因素等,而因為胚胎染色體數(shù)目異常原因?qū)е碌脑缙诹鳟a(chǎn)約占50%[2,3]。發(fā)生自然流產(chǎn)時的孕周越短,染色體異常的可能性會越大。目前國內(nèi)外有關(guān)流產(chǎn)組織染色體異常檢測的方法有很多,如絨毛培養(yǎng)染色體核型分析、FISH檢測技術(shù)、染色體微陣列分析及高通量測序技術(shù),極大地提高了流產(chǎn)組織染色體的分辨率和檢測成功率。其中高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速,通過對樣本進(jìn)行全基因組快速掃描,檢測出染色體小片段的缺失、重復(fù),用于檢測染色體拷貝數(shù)變異的優(yōu)勢越來越明顯,具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度、低成本等優(yōu)勢。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)檢測流產(chǎn)胚胎及絨毛組織,評估該技術(shù)的應(yīng)用價值及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年1月至2020年8月期間在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的不明原因早期胚胎停止發(fā)育的91例孕婦,年齡22-41歲,平均年齡31歲,平均孕周6-12周,經(jīng)B超提示胚胎停止發(fā)育(無心管搏動)。排除孕期感染及有害物質(zhì)接觸史。自愿要求流產(chǎn)絨毛組織染色體檢測者,簽署知情同意書。本研究經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 染色體拷貝數(shù)變異檢測

根據(jù)倫理要求,按照程序采集流產(chǎn)物組織,取3-5 mg組織研磨,將研磨好的組織放入56 ℃水浴鍋中消化過夜。通過試劑盒提取基因組DNA,純化,得到濃度為20 mg/μl的基因組DNA。根據(jù)建庫流程進(jìn)行文庫構(gòu)建(gDNA打斷,末端修復(fù),末端加“A”,接頭連接)。使用PCR技術(shù)擴增兩端帶有接頭的DNA片段。最后將一定量的文庫按照等物質(zhì)的量混合,上機測序?；谌旧w拷貝數(shù)變異的檢測方法,將每個讀長的測序堿基與人類基因組參考序列(hg19)進(jìn)行比對,通過唯一比對的讀長數(shù)據(jù)進(jìn)行染色體異常分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常的類型與分布情況

共檢測胚胎總數(shù)91例，檢測結(jié)果中50例染色體正常，41例染色體異常。檢出有非整倍體的染色體有2,8,9,12,13,14,15,16,19,22號染色體,以15,16,22,X為高發(fā)。檢出CNV中,其中片段≥5 Mb的CNV(5-26 Mb)6例(54.55%),主要有1,2,7,8,19號染色體上的重復(fù)/缺失,重復(fù)的片段有25.92 Mb和19.38 Mb;缺失的片段有14.82,14.96,19.36,24.32 Mb。片段<5 Mb的CNV(0.18-5 Mb)6例(54.55%),包括1,7,15,X號染色體上的微重復(fù)/微缺失,微重復(fù)的片段有1.70 Mb,微缺失的片段有0.50,0.64,0.20,0.42,0.18 Mb(見表1)。陽性樣本的分布情況見圖1。

表1 91例流產(chǎn)組織高通量測序檢測結(jié)果 (未完待續(xù))

圖1 41例陽性樣本染色體異常分布情況

2.2 流產(chǎn)樣本特征分布情況

所有患者中,發(fā)生流產(chǎn)事件主要集中在孕早期(9-10周),不同孕周間的卡方檢驗得出差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.941,P=0.242)。91例患者中,檢出異常者41例,異常率為45.05%;將早期胚胎停育流產(chǎn)樣本依據(jù)年齡分為4組:25-29歲38例;30-34歲26例;35-40歲19例;>40歲8例。產(chǎn)婦年齡超過35歲,染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高,但經(jīng)卡方檢驗得出差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.885,P=0.274);復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者41例(含連續(xù)兩次自然流產(chǎn)者25例,連續(xù)3次及以上流產(chǎn)者16例),染色體數(shù)目異常高于初次流產(chǎn)患者,經(jīng)卡方檢驗得出差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.231,P=0.135,見表2)。

表2 不同組別的流產(chǎn)組織染色體異常率比較 例(%)

3 討論

流產(chǎn)與多種因素有關(guān),比較常見的有產(chǎn)婦生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、病原微生物感染等,其中最主要原因是胚胎染色體異常[4,5]。孕婦及其家庭的悲傷與焦慮情緒迫切要求進(jìn)行流產(chǎn)原因的診斷,并指導(dǎo)下一胎的妊娠,所以對妊娠早期流產(chǎn)胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷,分析是否存在染色體異常,對探討孕婦在早期發(fā)生流產(chǎn)的病因及相應(yīng)的遺傳咨詢具有重要的意義。

目前,對于流產(chǎn)胚胎染色體方面的檢測,最常用的方法是FISH技術(shù),針對常見的染色體非整倍體(13,16,18,21,22三體及性染色體數(shù)目異常),及發(fā)現(xiàn)低比例嵌合,具有高效、特異性強等特點[6]。

細(xì)菌人工染色體標(biāo)記-磁珠分離法(BoSsTM)亦是針對流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常的一種檢測方式,可發(fā)現(xiàn)所有的非整倍體(除多倍體),具有高通量、快速等特點[7]。

染色體微陣列分析技術(shù)(CMA)是對整體基因組拷貝數(shù)的單次、高通量、高敏感性、高分辨率的檢測[8,9]。可檢出所有的染色體非整倍體、多倍體,還有部分三體,對染色體多處重復(fù)、缺失及染色體微缺失/微重復(fù)綜合征能有效檢出,能發(fā)現(xiàn)>20%的嵌合。相較其他方法有較大優(yōu)勢。

在本研究中我們應(yīng)用高通量測序技術(shù)來檢測流產(chǎn)組織的非整倍體和拷貝數(shù)變異,此技術(shù)具有高靈敏度、高特異度、高準(zhǔn)確度,能夠?qū)θ蚪M進(jìn)行快速掃描[10]。成本相對低廉,具有臨床實際應(yīng)用價值,實驗中檢出流產(chǎn)組織染色體CNV共91例,檢出異常41例,主要高發(fā)在8-9周,孕婦年齡30-40歲。陽性樣本中,以16,22,XO染色體發(fā)生異常幾率高,有文獻(xiàn)報道T16,T22是常染色體三體中導(dǎo)致習(xí)慣性流產(chǎn)最為常見的三體,會引起孕早期胎兒死亡、宮內(nèi)生長受限、先天性心臟缺損、嚴(yán)重的臟器畸形等癥狀[11,12]。雙重三體較為少見,約占流產(chǎn)胚胎所有核型的0.21%-2.8%[13]。本研究發(fā)現(xiàn)1例既有雙重三體又有單體的樣本,47,XN,+16,+22,-19,7q11.1-q11.23 del 14.96 Mb;及1例2號三體和19單體,46,XN,+2,-19,7q11.1-q11.23 del 14.82 Mb。主要發(fā)生原因是雙親之一的配子形成時或妊娠受精卵卵裂時出現(xiàn)染色體不分離。X染色體單體發(fā)生率越高越易造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn),XO綜合征,也稱特納綜合征(Turner syndrome),患者通常表現(xiàn)為身材矮小、性腺發(fā)育不良、胚胎早期停育等[14],并且性染色體單體流產(chǎn)兒多見于年輕孕婦。染色體病發(fā)生率與染色體長度及其基因數(shù)量有關(guān)[15]。

檢出CNV 11例,根據(jù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNV的片段中包含了一些臨床意義明確的功能性基因。例如1例檢測出4號染色體p16.3-p15.31區(qū)域有約19.38 Mb的重復(fù),此重復(fù)區(qū)域包括MKS3,CC2D2A和RPGRIP1L三個基因,這3個基因會引起眼-腦-肝-腎綜合征(COACH syndrome),數(shù)據(jù)庫Decipher、UCSC等顯示該區(qū)域重復(fù)的患者可能有智力發(fā)育遲緩、小腦發(fā)育不良、肺發(fā)育不良等臨床表現(xiàn)[16]。1例檢出15號染色體15q11.2區(qū)域有約0.64 Mb的缺失,該區(qū)域為致病區(qū)域,患者可能有異位腎、宮內(nèi)生長遲緩、小頭畸形等臨床表現(xiàn)[17]。2例檢出7號染色體7q36.1區(qū)域有缺失,包含了劑量敏感基因:KMT2C,經(jīng)查詢ClinGen數(shù)據(jù)庫資源,劑量致病性有充分證據(jù)(Haploinsufficiency Score:3)。該區(qū)域缺失的患者可能有精神運動發(fā)育遲緩、智力障礙多變和輕度畸形等臨床表現(xiàn)[18]。

本研究結(jié)果顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和初次流產(chǎn)的發(fā)生率分別為53.7%和38.0%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Grande等[19]復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者的異常率為60%,初次流產(chǎn)者的異常率為68%,差異也無統(tǒng)計學(xué)意義,與本研究結(jié)果基本一致,表示流產(chǎn)組織核型異常的風(fēng)險與流產(chǎn)次數(shù)無關(guān)。隨著女性年齡的增長,卵細(xì)胞在逐漸地衰老退化,受精卵細(xì)胞內(nèi)的紡錘絲老化,導(dǎo)致功能不全或部分喪失,易導(dǎo)致受精卵在減數(shù)或有絲分裂時染色體不分離,從而導(dǎo)致發(fā)生染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常。本研究的數(shù)據(jù)顯示年齡≥35歲組的異常發(fā)生率高于其他組,表明女方年齡越大,發(fā)生染色體異常的幾率越大。

綜上所述,高通量測序技術(shù)應(yīng)用于檢測孕早期流產(chǎn)組織的非整倍體及拷貝數(shù)變異具有較高的靈敏度、特異性和檢出率高,有明顯的技術(shù)優(yōu)勢,孕婦年齡越大,染色體非整倍體及拷貝數(shù)變異異常更易導(dǎo)致胎兒畸形、胚胎早期停育等。所以對自然流產(chǎn)的夫婦進(jìn)行染色體異常的檢測并進(jìn)行遺傳學(xué)病因分析,從而為幫助再次妊娠提供更多的指導(dǎo),相信隨著技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)必將為早期自然流產(chǎn)病因診斷提供更有意義的指導(dǎo)信息。