山西產(chǎn)酸棗仁HPLC-UV-ELSD特征圖譜及7個化學成分的含量測定

楊馥源,魏 潔,王玉龍,杜晨暉,閆 艷*,秦雪梅#

(1山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西振東道地藥材股份有限公司;3山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院;*通訊作者,E-mail:yanyan520@sxu.edu.cn;#共同通訊作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子,始載于《神農(nóng)本草本經(jīng)》[1],列為上品,是我國35種貴重中藥材之一,具有養(yǎng)心補肝、寧心安神、斂汗、生津之功效[2]。酸棗主要分布在我國北部的山西、河北等省,野生資源豐富,具有明顯的地域性。山西省自古以來就是酸棗仁的主產(chǎn)區(qū)之一,如《別錄》[3]云:“酸棗生河東川澤”,古之河東即指今山西、河北等地。酸棗在山西省屬于廣泛分布具有明顯優(yōu)勢的野生植物。本課題組[4-6]建立了山西產(chǎn)酸棗仁黃酮類和皂苷類成分的指紋圖譜。郭寶林課題組[7]研究表明酸棗仁中主要的黃酮類成分斯皮諾素含量高的產(chǎn)區(qū)有山西臨汾(包括大寧和吉縣)。由此可見,前期本課題組[4-6]、郭寶林課題組[7]、楊守娟等[8]、Shen等[9]和李飛鶴等[10]研究多集中于黃酮和皂苷類成分的分析,忽視了酸棗仁中生物堿類成分的分析及3種不同類型成分的同時分析。生物堿是酸棗仁中含量較高的一類成分[11],以異喹啉類、吲哚類和環(huán)肽類為主[12],其中環(huán)肽類生物堿可以協(xié)同戊巴比妥有效延長小鼠的睡眠時間,并且具有改善學習記憶的作用[13,14]。黃酮類和皂苷類成分同樣可以增加戊巴比妥誘導的睡眠時間[12],此外,皂苷類成分在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等方面具有廣泛的藥理作用[15]。以上三類成分均是酸棗仁鎮(zhèn)靜催眠的主要活性成分。

因此,本研究擬選擇山西酸棗優(yōu)質產(chǎn)區(qū)臨汾市大寧縣及運城市聞喜縣和晉中市榆次區(qū)3個地區(qū)的酸棗為研究對象。首先建立基于高效液相色譜-紫外-蒸發(fā)光檢測(HPLC-UV-ELSD)方法的酸棗仁中生物堿、黃酮和皂苷3類成分的特征圖譜,并對酸棗仁中烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、維采寧Ⅱ、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B進行含量測定。該研究將為山西產(chǎn)酸棗仁的道地性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要儀器:Waters e 2695高效液相色譜儀,配自動進樣器、四元梯度泵、柱溫箱、UV檢測器以及Empower色譜工作站(美國Waters公司);ELSD 6000蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰公司);CPA 225 D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);紫外可見分光光度計(北京普析公司)。

對照品烏藥堿(批號HC 225036298)、木蘭花堿(批號HA 061308198)、斯皮諾素(批號20160314)、酸棗仁皂苷A(批號20160315)和6?-阿魏酰斯皮諾素(批號20160313)均購于寶雞市辰光生物科技有限公司;維采寧Ⅱ(批號wkq 19061803購于四川省維克奇生物科技有限公司,酸棗仁皂苷B(批號20170210)購于南京春秋生物工程有限公司,以上對照品經(jīng)HPLC歸一化法測定質量分數(shù)均大于98%。乙腈和甲酸為色譜純,購于賽默飛世爾科技公司(中國),其他試劑均為分析純。

本次實驗所用酸棗仁樣品均為2019年9月初于山西省臨汾市大寧、晉中市榆次區(qū)和運城市聞喜縣3個地區(qū)手工采摘酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的種子。每個產(chǎn)地采集3批樣品,每批樣品不少于2 kg(見表1)。參考實地考察河北贊皇基地的酸棗仁加工流程,首先將新鮮采摘的酸棗置于通風干燥處晾曬;其次,將果肉干癟后的酸棗放入水中浸泡24 h,手工脫果肉;最后,果核烘干(40 ℃)7-8 h,砸碎后得到酸棗仁。按照2015年版《中華人民共和國藥典》酸棗仁含量測定方法進行水分測定,水分含量均低于9.0%,符合藥典標準。所有樣品均保存于山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心陰冷庫。

表1 山西不同產(chǎn)地采摘的酸棗樣本信息

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別稱取烏藥堿、維采寧Ⅱ、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對照品適量,精密稱定,分別加70%甲醇水制成濃度為1 mg/ml的母液;分別稱取木蘭花堿和斯皮諾素適量,精密稱定,分別加70%甲醇水制成2 mg/ml對照品母液。精密吸取各成分對照品母液,加70%甲醇水配制為含烏藥堿80 μg/ml、木蘭花堿320 μg/ml、維采寧Ⅱ 20 μg/ml、斯皮諾素200 μg/ml、6?-阿魏酰斯皮諾素180 μg/ml、酸棗仁皂苷A 200 μg/ml和酸棗仁皂苷B 100 μg/ml的混合對照品工作溶液。精密量取上述混合對照品工作溶液適量,用70%甲醇水逐級稀釋成7個濃度梯度的標準曲線工作溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約0.2 g,精密稱定,置索氏提取中,加石油醚(60-90 ℃)適量,加熱回流4 h,棄去石油醚,藥渣揮去溶劑,轉移至錐形瓶中,加入70%乙醇水20 ml,加熱回流2 h,濾過,濾渣用70%乙醇水5 ml洗滌,合并洗液與濾液,回收溶劑至干,殘渣加甲醇溶解,轉移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Apollo C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.1%甲酸水(A)和乙腈(B),梯度洗脫(0-26 min,10%-20% B;26-30 min,20%-23% B;30-43 min,23%-26% B;43-45 min,26%-37% B;45-47 min,37% B;47-54 min,37%-39% B;54-63 min,39%-100% B),流速為1.0 ml/min;柱溫25 ℃,進樣量10 μl;紫外檢測波長為227 nm和335 nm;ELSD參數(shù):漂移管溫度105 ℃,空氣體積流量為2.5 L/min。所有待測色譜峰在此條件下分離度良好(見圖1)。

1.烏藥堿(coclaurine);2.木蘭花堿(magnoflorine);3.維采寧Ⅱ(vicenin Ⅱ);4.斯皮諾素(spinosin);5.6?-阿魏酰斯皮諾素(6?-feruloylspinosin);6.酸棗仁皂苷A(jujuboside A);7.酸棗仁皂苷B(jujuboside B)

2 結果

2.1 特征圖譜

2.1.1 方法學考察

2.1.1.1 精密度試驗 取同一批酸棗仁樣品(編號S1)粉末,按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄各共有峰的保留時間和峰面積。結果顯示,HPLC-UV 227 nm和335 nm、HPLC-ELSD指紋譜圖中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.04%,表明儀器精密度良好。

2.1.1.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批酸棗仁樣品(編號S1)粉末,按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,分別于室溫放置0,3,6,9,12,24 h后,按“1.2.3”項色譜條件進樣分析,記錄各共有峰的保留時間和峰面積。結果顯示,HPLC-UV 227 nm和335 nm、HPLC-ELSD特征譜圖中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.27%,表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.1.3 重復性試驗 取同一批酸棗仁樣品(編號S1)粉末,按“1.2.2”項方法平行制備6份供試品溶液,按“1.2.3”項色譜條件進樣測定,記錄各共有峰的保留時間和峰面積。結果顯示,HPLC-UV 227 nm和335 nm、HPLC-ELSD特征譜圖中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.26%,表明該提取方法的重復性良好。

2.1.2 山西產(chǎn)酸棗仁特征圖譜的建立 取9批山西不同采收地點的酸棗仁樣品,按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項色譜條件依次進樣分析并將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(8.0版)”軟件,以S1號色譜圖為參考,中位數(shù)法建立對照圖譜,時間窗寬度設置0.1,選擇多點校正進行匹配。在HPLC-UV 227 nm圖譜中,9批酸棗仁樣品相似度為1,以2號色譜峰(木蘭花堿)為參照峰(S),計算1號色譜峰烏藥堿的相對保留時間為0.84(見圖2),在HPLC-UV 335 nm圖譜中,9批酸棗仁黃酮類成分的相似度為0.979-0.991。結果表明各批次樣品之間所含黃酮類成分相似度較高(見圖3)。以4號峰(斯皮諾素)為參照峰(S),峰3(維采寧Ⅱ)、峰5(6?-阿魏酰斯皮諾素)的相對保留時間分別為0.63和1.35。在HPLC-ELSD圖譜中,9批酸棗仁樣品皂苷類成分的相似度為0.995-0.999;以6號峰酸棗仁皂苷A峰作為參比峰(S),峰7(酸棗仁皂苷B)的相對保留時間為1.1(見圖4)。

R.9批對照特征圖譜;S1.批號D20190901;S2.批號D20190902;S3.生產(chǎn)批號D20190903;S4.批號W20190901;S5.批號W20190902;S6.批號W20190903;S7.生產(chǎn)批號Y20190901;S8.批號Y20190902;S9.批號Y20190903;1.烏藥堿;2.木蘭花堿(S峰)

3.維采寧Ⅱ;4.斯皮諾素(S峰);5.6?-阿魏酰斯皮諾素

6.酸棗仁皂苷A(S峰);7.酸棗仁皂苷B

2.2 酸棗仁中7個化學成分的含量測定

2.2.1 線性關系考察 取“1.2.1”項7個濃度梯度的標準曲線工作溶液,按“1.2.3”項色譜條件依次進樣分析。以指標成分的峰面積為縱坐標(Y),質量濃度為橫坐標(X),進行線性回歸,得回歸方程、相關系數(shù)(r)和線性范圍;按信噪比S/N=3計算7個指標成分的檢測下限(low limit of detection,LLOD),按信噪比S/N=10計算其定量下限(low limit of quantification,LLOQ),7個指標成分在各自質量濃度范圍內線性關系均良好(見表2)。

表2 七個指標成分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢測下限和定量下限

2.2.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品工作溶液,按“1.2.3”項色譜條件,連續(xù)進樣6次,記錄7個指標成分的峰面積,并計算其峰面積的RSD值,結果顯示,7個指標成分烏藥堿、木蘭花堿、維采寧Ⅱ、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B的RSD分別為3.42%,0.66%,0.58%,0.56%,0.64%,0.40%和0.58%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(S1),按“1.2.3”項色譜條件,分別于0,2,4,8,12,24 h進樣測定,計算烏藥堿、木蘭花堿、維采寧Ⅱ、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的色譜峰面積的RSD分別為2.95%,1.60%,0.94%,1.55%,0.93%,0.66%和2.01%,結果表明,供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

2.2.4 重復性試驗 取酸棗仁樣品(S1)粉末6份,每份約0.2 g,精密稱定,按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項色譜條件測定,計算7個成分的平均含量分別為:烏藥堿0.221 mg/g,木蘭花堿1.422 mg/g,維采寧Ⅱ0.074 mg/g,斯皮諾素0.697 mg/g,6?-阿魏酰斯皮諾素0.503 mg/g,酸棗仁皂苷A 0.714 mg/g和酸棗仁皂苷B 0.384 mg/g,其RSD范圍在1.95%-4.31%,表明提取方法的精密度良好。

2.2.5 加樣回收試驗 取已知含量的大寧產(chǎn)地酸棗仁樣品(S1)粉末約0.1 g,共6份,精密稱定分別加入與樣品中各成分含量相對應100%的對照品混合溶液,按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項色譜條件進樣,計算各成分回收率范圍,并計算相應的RSD值。結果顯示,烏藥堿、木蘭花堿、維采寧Ⅱ、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的平均回收率范圍均在90.55%-105.91%,RSD值均低于4.20%(見表3),表明提取方法的準確度良好。

表3 七種指標成分的加樣回收率 (n=6)

2.2.6 樣品測定 分別取不同批次的酸棗仁樣品粉末各3份,分別按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,按“1.2.3”項色譜條件進樣10 μl,用外標兩點法計算含量(以生藥量計),烏藥堿、木蘭花堿、維采寧Ⅱ、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的含量結果見表4。同時對不同產(chǎn)地同一成分的含量作單因素方差分析(ANOVA),發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地酸棗仁7個成分含量有明顯差異,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、酸棗仁皂苷A 4個成分在榆次產(chǎn)地顯著高于大寧和聞喜產(chǎn)地,說明以單一成分評價酸棗仁優(yōu)質產(chǎn)區(qū)具有一定的片面性,需要結合不同類別的多種成分同時評價。

表4 不同產(chǎn)地酸棗仁中7個成分的含量測定結果 (n=3,mg/g)

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

文獻調研表明,酸棗仁中黃酮類和皂苷類成分多為同分異構體,如斯皮諾素和異斯皮諾素、當藥黃素和異當藥黃素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷A1、酸棗仁皂苷B和酸棗仁皂苷B1等[12]。為了保證待測成分的專屬性,本研究對色譜條件進行了優(yōu)化,分別考察了乙腈-0.1%甲酸水及乙腈-0.1%冰醋酸水系統(tǒng),結果乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng),各類成分分離度良好,峰型對稱。分別對Agilent Zorbax SB-C18、Apollo C18和Phenomenex Luna C18色譜柱進行考察,結果表明,Apollo C18色譜柱對以上幾對同分異構體的分離效果好,且耐用性強。

3.2 黃酮類成分的含量分析

斯皮諾素和酸棗仁皂苷A為2015年版《中華人民共和國藥典》酸棗仁項下的含量測定指標。由測定結果可知,3個產(chǎn)地間酸棗仁中各組分含量差異較大,其中大寧和聞喜2個產(chǎn)地成分含量較為接近,榆次產(chǎn)地7個成分含量均高于其他地區(qū)。值得注意的是,《中華人民共和國藥典》規(guī)定酸棗仁斯皮諾素含量應當大于0.08%,大寧縣和聞喜縣均達不到這一標準。對于酸棗仁中的黃酮類成分斯皮諾素而言,達不到《中華人民共和國藥典》規(guī)定標準已是普遍現(xiàn)象。由此推測,不同產(chǎn)地樣品間各組分的含量差異可能是產(chǎn)地和采收期兩方面的因素導致的。因此,加強酸棗仁道地性研究,明確酸棗仁藥材的道地區(qū)劃,加強和規(guī)范酸棗仁飲片的生產(chǎn)規(guī)范化技術研究勢在必行。

本實驗在同一色譜條件下,建立了一種同時分析酸棗仁中3種不同類型成分的分析方法。建立的HPLC-UV-ELSD特征圖譜共標定了7個共有峰,可用于初步鑒定酸棗仁的品種來源。酸棗仁藥材根據(jù)產(chǎn)地不同,烏藥堿、木蘭花堿、維采寧Ⅱ、斯皮諾素、6?-阿魏酰斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B的含量存在顯著的差異,其中晉中市榆次區(qū)產(chǎn)酸棗仁中烏藥堿、木蘭花堿、斯皮諾素、酸棗仁皂苷A成分含量顯著高于其他兩個地區(qū)。基于不同類型成分含量的酸棗仁質量評價方法更加科學、合理。該方法專屬性強、準確,具備定性和定量雙重作用,為山西酸棗仁產(chǎn)地的道地性研究提供實驗依據(jù)。