心理應(yīng)激對小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及凋亡因子的影響

馬瑞紅，程蕊，劉妍，夏天

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193)

隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活節(jié)奏的日益加快，女性在社會與家庭中承擔(dān)了更多的責(zé)任，背負(fù)著巨大的壓力，易受應(yīng)激源的刺激從而產(chǎn)生心理應(yīng)激。心理應(yīng)激可干擾下丘腦-垂體-卵巢軸、下丘腦-垂體-腎上腺軸和下丘腦-垂體-甲狀腺軸，從而引起性激素、皮質(zhì)類固醇激素及甲狀腺素的變化[1]，導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌功能紊亂，嚴(yán)重?fù)p害女性的生殖功能[2]，甚至導(dǎo)致不孕。本課題組以現(xiàn)代“心理應(yīng)激”理論為基礎(chǔ)，前期研究發(fā)現(xiàn)心理應(yīng)激使小鼠血清活性氧簇(ROS)濃度升高，損傷卵巢組織的抗氧化系統(tǒng)，降低卵巢組織內(nèi)抗氧化酶含量，從而損害卵巢功能[3]。為進(jìn)一步探析心理應(yīng)激導(dǎo)致女性生殖功能下降的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制，本研究擬驗(yàn)證心理應(yīng)激是否損傷小鼠卵母細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)、是否損害卵母細(xì)胞功能及促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生，以期為心理應(yīng)激降低女性生殖功能提供新的科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及材料

1.實(shí)驗(yàn)動物：SPF級4～5周齡ICR未孕雌性小鼠80只，體重20～26 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2019-0002]。小鼠在人工控制環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食及飲水，光照時間12 h，室溫24℃。動物購入后適應(yīng)性喂養(yǎng) 1～2 d后納入實(shí)驗(yàn)。

2.主要試劑：孕馬血清促性腺激素(PMSG)、HCG購于北京索萊寶科技有限公司，M2培養(yǎng)基、透明質(zhì)酸酶購于美國Sigma公司，活性氧(ROS)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，TRIZOL一步法RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)，Anti-actin、Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-Caspase-3和Anti-Cytochrome C均為抗兔單克隆體(Cell Signaling Technology，美國)，SuperScript III RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI-invitrogen，美國)，Sybr qPCR Mix(ABI-invitrogen，美國)。

3.主要儀器：體視顯微鏡(Nikon，日本)、熒光酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)、qPCR儀(Applied biosystems，美國)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)。

二、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組及心理刺激實(shí)驗(yàn)：將80只ICR雌性小鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常組、心理應(yīng)激強(qiáng)刺激組、心理應(yīng)激中刺激組和心理應(yīng)激弱刺激組，給予各心理應(yīng)激組小鼠不同程度且不可預(yù)知性刺激(具體制備過程詳見文章[3])，心理應(yīng)激強(qiáng)刺激組：每天給予2次不同的刺激；心理應(yīng)激中刺激組：每天給予1次不同的刺激；心理應(yīng)激弱刺激組：隔天給予1次不同的刺激；同時選取不給予任何干預(yù)的正常小鼠為正常組。心理應(yīng)激組小鼠連續(xù)刺激6周，并通過刺激前后小鼠體重、刺激后曠場試驗(yàn)及糖水偏好指數(shù)，證實(shí)心理應(yīng)激小鼠模型制備成功[3]。

2.卵母細(xì)胞收集：建模后各組小鼠在動情前期腹腔注射PMSG 7.5 U，46 h后腹腔注射HCG 7.5 U，16 h后頸椎脫臼快速處死小鼠，用75%乙醇消毒腹部，分別在輸卵管和卵巢之間靠近輸卵管的子宮部剪開，將斷離的輸卵管放入小玻璃皿中的M2培養(yǎng)液中。另一側(cè)輸卵管重復(fù)同樣操作。在體視顯微鏡下，左手用鑷子按壓一端，右手用針尖劃開輸卵管膨大的壺腹部，使卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)溢出，用提前拉好的口吸管將COCs從M2培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到0.1%透明質(zhì)酸酶的液滴中，37℃消化30 s～1 min，脫去顆粒細(xì)胞，待卵團(tuán)自然分散成單個細(xì)胞，開始清洗，用口吸管把卵母細(xì)胞在M2培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移3次，洗去顆粒細(xì)胞和透明質(zhì)酸酶，備用。

3.ROS濃度檢測：采用DCFH-DA探針進(jìn)行小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的測定，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，去除培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，以能充分蓋住細(xì)胞為宜。將不加探針，只加培養(yǎng)液的卵母細(xì)胞設(shè)為陰性對照管；陽性對照管用加入探針的卵母細(xì)胞，同時加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞。37℃孵育細(xì)胞30～60 min，吸去培養(yǎng)液，用PBS反復(fù)吹打，肉眼觀察瓶底由半透明轉(zhuǎn)為透明，細(xì)胞層幾乎全部吹打至PBS中，將細(xì)胞懸液全部收集到1.5 ml EP管中，用PBS洗滌2次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，1 200 g，離心5 min，吸凈上清加入PBS重新懸浮細(xì)胞，用熒光酶標(biāo)儀在500 nm波長下測定ROS吸光度。

4.RT-PCR：收集卵母細(xì)胞于離心管中，用Trizol法按照試劑盒步驟提取RNA后測濃度，并反轉(zhuǎn)為cDNA備用。應(yīng)用RT-PCR法測定卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT、GSH-Px抗氧化酶和Bcl-2、Bax、CytC、Caspase-3凋亡因子mRNA水平的相對表達(dá)情況，根據(jù)目的基因分別設(shè)計(jì)合成引物，引物序列見表1。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃變性2 min，94℃退火20 s，60℃延伸 20 s，72℃ 30 s(40個循環(huán))擴(kuò)增完畢后，根據(jù)CT值(目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))，以β-actin為內(nèi)參照基因。

表1 引物序列

5.Western blot：取對數(shù)生長期卵母細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，PBS洗后收集于離心管中，加入1 ml PBS重懸細(xì)胞，500g離心5 min，加入5倍體積的裂解液，混勻，冰浴中以最大功率超聲破碎細(xì)胞3次，每次10 s，4℃，13 000g離心15 min。上清BCA法測定蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液將蛋白定量為5 mg/ml。制備SDS-PAGE 10%分離膠、5%濃縮膠。把樣本加至凝膠孔中，每孔上樣10 μl。凝膠電泳完畢后，轉(zhuǎn)膜，將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉，將一抗工作液(1∶1 000)加入封閉后的膜中，4℃反應(yīng)過夜，用1×TBST洗滌4次，之后放入配置好的二抗工作液(1∶2 000)中，搖床孵育1 h，1×TBST洗膜，洗去游離二抗，按1∶1(v/v)混合ECL試劑盒中兩種液體，將上述混合液均勻鋪在PVDF膜表面，室溫作用4 min。抖掉膜上液體，將其放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。以Actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度

各心理應(yīng)激刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度均顯著高于正常組(P<0.05)；進(jìn)一步兩兩比較顯示，隨著刺激強(qiáng)度的增加小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS濃度逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

注：組間相互比較，*P<0.05

二、各組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT和GSH-Px 的mRNA表達(dá)水平

各心理應(yīng)激刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD2、CAT和GSH-Px的mRNA表達(dá)水平均顯著低于正常組(P<0.05)；進(jìn)一步兩兩比較顯示，隨著刺激強(qiáng)度的增加，小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達(dá)水平逐漸降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

注：組間相互比較，*P<0.05

三、各組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平比較

各心理應(yīng)激刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因表達(dá)水平均顯著低于正常組(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，隨著刺激強(qiáng)度的增加，小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因表達(dá)水平逐漸降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；心理應(yīng)激各刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bax、CytC和Caspase-3基因表達(dá)水平均顯著高于正常組(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，隨著刺激強(qiáng)度的增加，小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bax、CytC和Caspase-3基因表達(dá)水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

注：組間相互比較，*P<0.05

四、各組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

各心理應(yīng)激刺激組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)水平均顯著低于正常組(P<0.05)；Bax、CytC和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組(P<0.05)；進(jìn)一步兩兩組間比較顯示，隨著刺激強(qiáng)度的增加小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著刺激強(qiáng)度的增加小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；強(qiáng)刺激組與弱刺激組CytC蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

A：Western Blot；B～E：灰度分析柱狀圖；注：組間相互比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

討 論

隨著社會的快速發(fā)展及女性對自身價(jià)值的完美追求，諸多因素給現(xiàn)代女性帶來了巨大的心理壓力，使女性持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)，嚴(yán)重影響其生殖功能。氧化應(yīng)激(OS)是導(dǎo)致不孕的重要因素，其不但能夠誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的退化和凋亡，還可以致使胚胎DNA損傷以及基因突變[4]。OS使氧化產(chǎn)物增加的同時降低了抗氧化酶的活性[5]。氧的某些代謝物和衍生物主要以超氧自由基(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H2O2)3種類型存在，被統(tǒng)稱為ROS[6]。正常情況下，ROS的產(chǎn)生和清除可以保持動態(tài)平衡，當(dāng)ROS產(chǎn)生增加和(或)細(xì)胞的抗氧化功能受損，機(jī)體不能及時有效清除時ROS則會累積，其與脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)相互作用，致使細(xì)胞OS損傷[7-8]。哺乳動物的卵母細(xì)胞與胚胎內(nèi)部清除ROS的抗氧化物系統(tǒng)是由酶性以及非酶性系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)的。酶性抗氧化物主要有SOD、GSH-Px和CAT等。

SOD催化超氧化物歧化成氧和(過氧化氫)H2O2，然后通過CAT將H2O2轉(zhuǎn)化為氧和水，從而達(dá)到對抗OS的目的[9]。SOD家族內(nèi)包括SOD1、SOD2和SOD33種抗氧化酶，且這三者都能夠清除超氧化物陰離子，因此SOD家族在抗氧化過程中起重要作用[10]。SOD2位于線粒體中，是清除細(xì)胞內(nèi)ROS最主要的抗氧化酶。CAT主要存在于機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞器中，它通過催化分解H2O2使其發(fā)生反應(yīng)生成完全無害的水和氧氣來發(fā)揮自身的抗氧化作用，而其催化分解H2O2則主要是通過細(xì)胞內(nèi)的三羧酸循環(huán)來完成的[11]。GSH-Px通過參與還原型谷胱甘肽(GSH)的氧化還原循環(huán)，一起將脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為無毒產(chǎn)物，從而保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體的完整性。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡的過程，受基因控制，對生物發(fā)育和維護(hù)體內(nèi)平衡有重大意義[12-13]。在一定的細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)下，線粒體外膜釋放可溶性血蛋白Bax、CytC、AIF、內(nèi)切酶G等膜間空間蛋白，不可逆激活下游Caspase促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程[14]。Bcl-2家族蛋白通過調(diào)控線粒體功能和CytC的釋放從而在細(xì)胞凋亡中起重要作用，Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達(dá)量決定細(xì)胞凋亡程度[15-16]。Bax是Bcl-2家族中最早被發(fā)現(xiàn)的促凋亡因子，調(diào)控釋放CytC并激活Caspase促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激環(huán)境中，CytC從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)與Apaf-1結(jié)合形成凋亡小體，誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。正常情況下，Caspase-3以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞凋亡信號出現(xiàn)后，不同細(xì)胞凋亡途徑誘發(fā)的各類蛋白水解酶可分別切割并激活Caspase-3，被激活的Caspase-3通過剪切Caspase底物而引起級聯(lián)反應(yīng)并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。本實(shí)驗(yàn)中隨著心理應(yīng)激刺激強(qiáng)度的增強(qiáng)，小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)抑凋亡相關(guān)因子Bcl-2水平逐漸降低，促凋亡相關(guān)因子Bax、CytC、Caspase-3水平逐漸升高，說明心理應(yīng)激可促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞的凋亡，且心理應(yīng)激程度越強(qiáng)小鼠卵母細(xì)胞凋亡程度越顯著。本實(shí)驗(yàn)中各心理刺激組比正常組小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.05)，SOD2、CAT和GSH-PxmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，表示抗氧化酶活性降低使其不足以清除卵母細(xì)胞內(nèi)過量累積的ROS，最終導(dǎo)致OS從而損傷卵母細(xì)胞質(zhì)量和功能。

課題組前期試驗(yàn)證實(shí)了心理應(yīng)激能夠激發(fā)小鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)，抑制下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)，影響小鼠內(nèi)分泌及卵巢儲備功能導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常[19]；長期處于慢性心理應(yīng)激狀態(tài)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)ROS累積，損傷卵巢組織的抗氧化系統(tǒng)，降低卵巢組織內(nèi)抗氧化酶含量，從而損害卵巢功能[3]。在以上研究結(jié)論的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討心理應(yīng)激對小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及凋亡因子的影響。本研究結(jié)果證實(shí)了心理應(yīng)激可引發(fā)卵母細(xì)胞內(nèi)OS反應(yīng)，損傷卵母細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)卵母細(xì)胞的凋亡，希望可以提醒生殖醫(yī)學(xué)專家在臨床治療中重視心理應(yīng)激對女性不孕癥患者的影響，關(guān)注患者的負(fù)面情緒，對心理負(fù)擔(dān)重的患者主動進(jìn)行心理疏導(dǎo)，注重心理干預(yù)和心理治療，給予她們?nèi)轿?、多角度的支持和人文關(guān)懷，并倡導(dǎo)育齡期女性平時要關(guān)注情志調(diào)節(jié)，注重心理健康。