不明原因復發(fā)性流產(chǎn)女性FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性研究

曹琴英，彭園園，穆衛(wèi)紅，孫東蘭，張靜

(石家莊市第四醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，石家莊 050000)

臨床上自然流產(chǎn)的發(fā)生率為15%～25%，其中≥2次流產(chǎn)的患者約占生育期婦女的5%，而≥3次者約占1%。復發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)有多種原因，主要包括遺傳因素、解剖因素、內分泌因素、感染因素、免疫功能異常、血栓前狀態(tài)、孕婦的全身性疾病及環(huán)境因素等[1]。然而，50%的RSA患者病因不明。其中，遺傳因素被認為是主要的潛在原因[2]。

脆性X智力障礙l號基因(Fragile X Mental Retardation 1，F(xiàn)MR1)，又稱家族性智力低下基因，位于染色體Xq27.3。FMR1基因5’端非編碼區(qū)CGG三核苷酸串聯(lián)重復序列具有高度多態(tài)性。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學學院(ACMG)的脆性X檢測標準和指南[3]，5～44個CGG重復為正常，45～54個CGG重復為中間型，55～200個CGG重復為前突變，大于200個CGG重復為全突變。全突變的臨床表型即為脆性X綜合征，在臨床上有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現(xiàn)。

近年來，多項研究顯示，CGG重復序列多態(tài)性可能在女性不明原因RSA中發(fā)揮重要作用。目前，我國尚缺乏大樣本育齡女性FMR1基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)，探討RSA患者FMR1基因CGG重復序列數(shù)是否高于普通人群的研究更少。本研究旨在對不明原因RSA女性FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性的分布特點進行分析，以期為自然流產(chǎn)的病因學研究提供參考。

資料和方法

一、研究對象

研究人群為2018年1月1日至2019年12月31日從石家莊市第四醫(yī)院復發(fā)性流產(chǎn)門診招募的不明原因RSA患者。RSA定義為3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失。但大多數(shù)專家認為，連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應重視并予評估，因其再次出現(xiàn)流產(chǎn)的風險與3次者相近[1]。

納入標準：漢族；年齡<40歲，以最大限度減少因卵巢老化導致的流產(chǎn)患者；連續(xù)≥2次孕20周以內的妊娠丟失，且臨床及實驗室檢查未檢出明確原因。排除標準：感染引起的流產(chǎn)史、當前處于妊娠期或產(chǎn)褥期、血栓性疾病、深靜脈血栓形成或肺部病史、子宮或輸卵管解剖異常、宮頸機能不全、骨盆手術史(不包括剖宮產(chǎn))、酗酒/藥物濫用、癌癥史、染色體異常核型以及輔助生殖技術助孕者。

以同期于石家莊第四醫(yī)院婦科門診就診的年齡匹配(±2歲)的無流產(chǎn)史婦女為對照組。

本研究經(jīng)石家莊市第四醫(yī)院倫理評審委員會批準。所有研究對象均自愿進行該項檢查，并簽署知情同意書。

二、研究方法

1.樣品采集與DNA提?。撼槿⊙芯繉ο笸庵莒o脈血2 ml，EDTA抗凝。使用QIAamp全血DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)提取DNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。NanoDrop 1000(Nanodrop，美國)測定DNA濃度。

2.FMR1基因CGG重復數(shù)檢測：采用FMR1基因CGG重復數(shù)檢測試劑盒(熒光PCR-毛細管電泳法，北京閱微基因技術)檢測FMRl基因的CGG重復次數(shù)。按試劑盒的說明操作，主要步驟如下：(1)建立PCR擴增體系：15 μl全長擴增體系，包括擴增緩沖液11.5 μl、全長擴增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、無核酸酶純水1.6 μl，充分混勻后加入待檢測1 μl DNA樣本；15 μl重復擴增體系，包括擴增緩沖液11.5 μl、重復擴增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、無核酸酶純水1.6 μl，充分混勻后加入待檢測1 μl DNA樣本。(2)PCR反應條件：兩種PCR擴增體系的反應條件相同，均為95℃ 5 min，97℃ 35 s、65℃ 35 s(在此步驟中，每1個循環(huán)減1℃)、68℃ 4 min共10個循環(huán)；然后接97℃ 35 s、62℃ 35 s、68℃ 4 min(在此步驟中，每1個循環(huán)增加20 s)，共20個循環(huán)；68℃ 10 min后，連接15℃完成擴增反應。(3)毛細管電泳：HiDi Formanmide(ABI，美國)8.7 μl、QD1200(ABI，美國)0.3 μl、PCR產(chǎn)物1 μl配制電泳檢測樣品，使用POP7膠(ABI，美國)在Applied Biosystems 3500xl DNA測序儀(ABI，美國)上進行毛細管電泳檢測。選擇“Fragment”電泳方法，具體操作按使用說明書。

3.結果分析：檢測數(shù)據(jù)使用GeneMapper分析軟件(ABI，美國)進行數(shù)據(jù)分析。具體操作步驟參考GeneMapper分析軟件用戶使用手冊。采用目前國內外普遍采用的分類：(1)正常重復范圍(n=5～44)；(2)中間型(n=45～54)；(3)前突變(n=55～200)；(4)全突變(n>200)。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。在同一個體中FMRl的兩個等位基因(CGG)重復次數(shù)相對少者定義為allele-1，相對多者定義為allele-2，取allele-2的重復數(shù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；比較兩個隊列之間的顯著性水平，采用Fisher精確檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者一般情況

研究組共納入不明原因RSA患者340例，平均年齡(32.5±3.2)歲，平均流產(chǎn)次數(shù)(2.51±0.53)次。其中，流產(chǎn)2、3、4、5次的患者分別有206例(60.60%)、100例(29.40%)、30例(8.82%)和4例(1.18%)。對照組340例，平均年齡(32.3±3.3)歲。兩組病例年齡比較無顯著性差異(P>0.05)。

二、兩組CGG重復序列數(shù)比較

研究組CGG重復序列數(shù)范圍為15～70次，平均(29.29±5.31)次。共30種不同的CGG重復數(shù)，頻率最大的重復次數(shù)為29次(41.5%)，其次為30次(38.8%)、36次(8.2%)。

對照組CGG重復序列數(shù)范圍為17～48次，平均(28.88±5.97)次。共29種不同的CGG重復數(shù)，頻率最大的重復次數(shù)為29次(43.2%)，其次為30次(42.6%)、31次(2.9%)。

兩組間CGG重復序列數(shù)比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組FMRl基因CGG重復序列分布比較[n(%)]

三、兩組CGG重復序列分型比較

兩組均無全突變型攜帶者。研究組FMRl基因中間型患者8例(2.35%)，對照組FMRl基因中間型1例1/340(0.29%)，組間比較有顯著差異(P<0.05)；研究組FMRl基因前突變患者2例(0.59%)，對照組無FMRl基因前突變攜帶者，組間比較無顯著性差異(P>0.05)；研究組中CGG重復≥35次的正常等位基因患者35例(10.29%)，對照組12例(3.53%)，組間比較有顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 研究組與對照組CGG重復序列數(shù)比較[n(%)]

討 論

文獻報道，F(xiàn)MR1基因前突變與卵巢早衰顯著相關，前突變攜帶者卵巢早衰(POF)發(fā)病率高達13%，自然絕經(jīng)時間較早，與卵巢儲備功能相關的指標如血清抗苗勒管激素(AMH)、基礎FSH水平等出現(xiàn)異常[4-5]。而且有學者指出，卵巢儲備功能減退相關的卵母細胞特異性基因與RSA相關，并提出在不明原因的RSA患者中進行上述相關基因的檢測[6]。因此，我們推測FMR1基因在RSA中亦發(fā)揮作用。

最近，國內外數(shù)篇文獻報道了FMR1基因CGG重復序列多態(tài)性與反復流產(chǎn)之間的關系。希臘一項前瞻性病例對照研究，對49名≤40歲的不明原因RSA女性及49例年齡匹配的正常女性進行檢測發(fā)現(xiàn)，CGG重復次數(shù)存在顯著差異(P=0.027)，流產(chǎn)患者前突變攜帶風險顯著高于正常對照組(OR=4.267)[7]。印度Dean等[8]研究顯示，與對照組相比，RSA組中間型等位基因攜帶者頻率更高(5/100 vs.2/100)；此外，RSA組CGG重復數(shù)≥35個的正常等位基因的比例更高(24/200 vs.8/200)，單純CGG重復序列(無AGG嵌入)的比例顯著增加(15/200 vs.3/200，P=0.006)。這種單純CGG重復序列數(shù)在下一代中易發(fā)生增加，可能具有導致反復流產(chǎn)的致病性后果。國內陳蔚琳等[9]進行的全國多中心橫斷面研究顯示，反復生育失敗婦女的FMRl基因前突變攜帶者發(fā)生風險較高，為1/369。針對中國北方育齡期婦女的研究顯示，具有自然流產(chǎn)史或因胚胎發(fā)育遲緩而人工流產(chǎn)史女性的前突變攜帶率為1/320，高于無流產(chǎn)史女性的1/756[10]。馮旺琴等[11]研究發(fā)現(xiàn)，早期自然流產(chǎn)患者FMRl基因中間型攜帶率與對照組無顯著差異(1/222 vs.1/247)，但前突變攜帶率顯著高于對照組(1/400 vs.1/740，P<0.05)。但本研究發(fā)現(xiàn)，不明原因RSA患者FMR1基因的中間型和正常范圍內的高CGG重復序列數(shù)攜帶比例均顯著高于對照組，而前突變攜帶率并未顯著增加，這與國內馮旺琴等[11]研究結果不同，但與Dean等[8]的研究結果相似。分析可能的原因：一方面可能是本研究的樣本量太小，導致了數(shù)據(jù)偏倚；此外，受試者的遺傳背景可能存在一定的地區(qū)差異；再者，受試者納入/排除標準有所差異。本研究的入組標準更為嚴格，且最大年齡較馮旺琴等[11]研究更小，以最大限度減少因卵巢老化導致的流產(chǎn)患者；而且流產(chǎn)孕周截止時間為孕20周以內，而馮旺琴等[11]研究的受試者均為孕早期(孕5～12周)RSA患者。上述差異可能導致了兩項研究結果的不一致。對于我國不明原因RSA患者的FMR1基因CGG重復序列分型特點，尤其與不明原因RSA的相關性還有待更多更大樣本量的、設計更嚴謹?shù)难芯坑枰躁U明。

回顧文獻，F(xiàn)MR1中間型等位基因與生育力降低、月經(jīng)不規(guī)則、更年期提前、原發(fā)性卵巢功能不全(POI)、非整倍體發(fā)生率更高以及流產(chǎn)相關[8]。在POI和卵巢儲備功能降低患者中，較大的正常等位基因重復頻率增加[12]。Kline等[13]的研究顯示，與對照組相比，F(xiàn)MR1基因CGG重復序列數(shù)增多在三體性自然流產(chǎn)的婦女中所占比例更高。Kline等[13]曾推測流產(chǎn)的增加可能與卵巢卵母細胞池的減少有關，F(xiàn)MRl基因的前突變攜帶者，卵巢儲備功能下降，二者之間可能存在某種關聯(lián)[14-16]。中間型和較大的正常型FMR1等位基因很可能導致卵巢儲備減少，在這種情況下，受損的卵母細胞質量最終可能導致致命的遺傳缺陷，如非整倍體，從而導致流產(chǎn)。這一假設得到了如下研究結果的支持：CGG重復次數(shù)大于30次的女性卵巢儲備減少，AMH和FSH水平等卵巢功能參數(shù)異常[17-18]。研究證實，血清AMH水平的降低和血清FSH水平的升高與流產(chǎn)相關，從而提供了中間型和較大的正常型FMR1等位基因與RSA相關的證據(jù)[8]。

2013年Banerjee等[19]觀察到，在不明原因RSA患者中，PGE2的表達顯著增加。脆性X智力障礙相關蛋白1(FXR1)是脆性X智力低下綜合征蛋白(FMRP)的同源物，與FXR2結合形成RNA結合蛋白的FXR家族[20]。FXR蛋白靶向RNA結合域[21]具有與轉錄后調控作用(可能包括mRNA核質穿梭以及翻譯)相一致的特征[22]。2019年最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR1敲除可促進原代細胞滋養(yǎng)層中PGE2的產(chǎn)生。這些結果提示FXR1參與RSA的發(fā)病機制。FXR1可能是一種新的COX-2調節(jié)因子。與健康對照組相比，RSA患者的滋養(yǎng)層FXR1 mRNA表達水平顯著降低，COX-2 mRNA表達水平升高。因此，F(xiàn)XR1在早孕中起著關鍵作用，可能是RSA的潛在治療靶點[23]。

本研究的主要局限性在于我們沒有分析病例組和對照組的AMH和FSH水平。因此，需要進一步的前瞻性研究來證實FMR1基因CGG重復序列與反復妊娠丟失之間的可能聯(lián)系，并揭示相關的分子機制。

綜上，我們檢測了不明原因RSA女性中FMR1基因CGG重復序列數(shù)的分布情況。結果表明，較大的正常型以及中間型FMR1等位基因可能在不明原因的RSA中發(fā)揮作用。未來還需要對此進行更多的研究，以揭示其分子機制。