miR-9-5p調(diào)控雄激素受體的表達(dá)促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖

王芳，楊麗華，余柯達(dá)，何健英，鄒立波

(金華市人民醫(yī)院生殖中心，金華 321000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種女性最常見的內(nèi)分泌失調(diào)疾病，影響大約5%～10%育齡婦女[1-2]。PCOS主要以高雄激素血癥、慢性無排卵和多囊卵巢為主要臨床表現(xiàn)，并常伴有痤瘡、脫發(fā)、皮脂溢、肥胖、多毛癥和棘皮癥等[3]。當(dāng)前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢顆粒細(xì)胞(KGN)的異常增殖與PCOS的形成有密切關(guān)系[4-5]。因此，探究KGN增殖潛在的調(diào)控機(jī)理將為PCOS的治療提供新的方案。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類高度保守的小型非編碼RNA，通過與目標(biāo)mRNA 3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯[6]。先前已有大量研究證明，異常表達(dá)的miRNAs與人類多種疾病的病理過程有關(guān)，包括腫瘤、炎癥性疾病、代謝性疾病及PCOS等[7]。當(dāng)前研究者已發(fā)現(xiàn)數(shù)十種miRNAs通過調(diào)控KGN增殖而在PCOS形成中發(fā)揮重要作用，如miR-19b[8]、miR-27a-3p[9]、miR-145[10]及miR-320a[11]等。但是，關(guān)于miR-9-5p在PCOS中的研究尚未見諸報(bào)道。本研究旨在比較miR-9-5p在PCOS患者及健康女性血清中的表達(dá)特征，分析在PCOS中的診斷價(jià)值，并探討對(duì)KGN增殖的作用及機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.研究對(duì)象：收集2018年1月至2019年10月于金華市人民醫(yī)院生殖中心就診的50例PCOS患者為實(shí)驗(yàn)組，以體檢科進(jìn)行健康體檢的50例健康女性為對(duì)照組。所有參與者要求年齡為18～35歲。實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)[12]：(1)閉經(jīng)或少經(jīng)(每年<8個(gè)月經(jīng)周期)；(2)臨床或生化檢查提示高雄激素血癥，臨床高雄激素血癥[13]診斷標(biāo)準(zhǔn)：多毛癥，且Ferriman-Gallwey評(píng)分≥3；生化高雄激素血癥[14]：根據(jù)正常月經(jīng)的健康女性的睪酮水平，將總睪酮水平或游離睪酮水平定為高于第95個(gè)百分點(diǎn)(總睪酮>67 ng/dl或游離睪酮>0.84 ng/dl)。對(duì)照組為月經(jīng)正常、卵巢功能正常、無高雄激素血癥的女性。所有參與者排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥，庫欣綜合征，過去3個(gè)月內(nèi)服用過藥物(類固醇、避孕藥、二甲雙胍或噻嗪類利尿劑等)。

本研究經(jīng)金華市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有參與者均簽署知情同意書。

2.主要試劑及儀器：Trizol與Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen，美國(guó))，反轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒(QIAGEN，德國(guó))，PCR引物(上海生工生物工程)，DMEM培養(yǎng)基、FBS與雙抗(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，miR-9-5p拮抗劑(antagomir)與陰性對(duì)照(antagomir control)(蘇州吉瑪基因)，MTT與DMSO(Sigma-Aldrich，美國(guó))，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析系統(tǒng)(Promega，美國(guó))，兔抗人單克隆AR抗體(ab108341)、兔抗人單克隆GAPDH抗體(ab181602)及山羊抗兔HRP二抗(ab6721)均購自英國(guó)Abcam，。全自動(dòng)生化測(cè)試儀(BK-1200#，濟(jì)南博科生物)，熒光定量PCR儀(7500HT/FAST#，ABI，美國(guó))，酶標(biāo)儀(680#，BIO-RAD，美國(guó))，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-18AC#，SANYO，日本)，流式細(xì)胞儀(CytoFLEX#，Beckman，德國(guó))。

二、研究方法

1.生化檢測(cè)：測(cè)量所有參與者的身高和體重，并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI)。通過化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)量睪酮(T)水平，通過葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)水平，通過放射免疫法測(cè)定空腹胰島素(fasting serum insulin，F(xiàn)INS)及黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)及抗苗勒管激素(AMH)水平。

2.RNA提取和qRT-PCR：從所有參與者肘前區(qū)域采集5 ml全血樣品，部分分離血清并置于-80℃保存。按照試劑說明，從剩余全血樣品中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 150 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以小核U6基因作為miR-9-5p的內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-9-5p引物序列：上游引物5′-CGAGCTCTGTGTGTGTGTGTGTGTG-3′，下游引物5′-TTCCGCGGCCGCTATGGCCGAGGAA-3′；U6引物序列：上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)量[15]。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：KGN購自日本茨城縣理研生物資源中心，培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為3組，分別為空白組、antagomir control及antagomir組?？瞻捉M細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，而antagomir control及antagomir組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染antagomir control及antagomir。具體操作如下：轉(zhuǎn)染前一天，將KGN以2×105/孔的密度接種到6孔板中。使用Lipofectamine 2000試劑分別按照說明書進(jìn)行antagomir和antagomir control的轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后的KGN在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于qRT-PCR檢測(cè)。

5.MTT：將KGN以6×103/孔的濃度接種在96孔板中，并用antagomir和antagomir control進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，將20 μl MTT(5 mg/ml)添加到每個(gè)孔中，并再孵育4 h。然后通過離心(1 000g×5 min，室溫)棄去上清液，并向每個(gè)孔中加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)以溶解結(jié)晶。使用ELx808酶標(biāo)儀測(cè)量每孔在490 nm波長(zhǎng)的吸光度(OD)。

6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)：將轉(zhuǎn)染后的KGN細(xì)胞接種在6孔板中，并培養(yǎng)48 h后，用PBS洗滌兩次并重懸。然后向細(xì)胞中加入70%的冷乙醇，混合后在4℃下孵育過夜。第二天離心收集細(xì)胞，在黑暗條件下向每個(gè)樣品中添加2 μl RNA酶(RNase)和300 μl碘化丙啶(PI)染料溶液，混合并在室溫和黑暗環(huán)境中孵育30 min。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各樣品的細(xì)胞周期。

7.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：通過PCR擴(kuò)增含野生型或突變型miR-9-5p結(jié)合位點(diǎn)的AR mRNA 3′-UTR的部分片段，并將其克隆到pMIR載體的螢火蟲報(bào)告基因的下游，產(chǎn)生重組載體AR-wt和AR-mut。使用Lipofectamine 2000試劑將構(gòu)建的重組載體AR-wt和AR-mut與antagomir和antagomir control共轉(zhuǎn)染到KGN中。轉(zhuǎn)染后48 h，使用Promega公司提供的雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化各樣品的螢火蟲熒光素酶活性。

8.Western Blotting：按照蛋白裂解液RIPA說明書，提取處理后KGN的總蛋白，將30 μg總蛋白質(zhì)收集在上樣緩沖液中，12%SDS-PAGE電泳分離，隨之轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與5%的牛奶封閉30 min，然后與抗AR(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶2 500稀釋)抗體在4℃下孵育過夜，并采用TBS-T緩沖液洗滌3次，每次5 min。將膜與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶3 000稀釋)在室溫下孵育1 h，并采用TBS-T緩沖液洗滌3次，每次5 min。使用Bio-rad ChemiDoc MP Imaging系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，并利用Image Lab 軟件分析各條帶的光密度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組研究對(duì)象的一般臨床資料和內(nèi)分泌參數(shù)比較

兩組研究對(duì)象的年齡及BMI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清中T、FPG、FINS、LH及AMH水平均顯著升高，而FSH水平則顯著降低(P<0.05)(表1)。

表1 兩組一般資料和內(nèi)分泌參數(shù)比較

二、miR-9-5p在PCOS患者血清中表達(dá)特征及診斷價(jià)值

調(diào)整年齡和BMI后，miR-9-5p在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清中的相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.037±0.018)和(0.022±0.014)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.51，P<0.001)(圖1A)。ROC曲線顯示，miR-9-5p在診斷PCOS中AUC為0.76，敏感性為65.43%，特異性為74.09%(P<0.001)(圖1B)。

A：兩組血清中miR-9-5p的表達(dá)水平；B：miR-9-5p 診斷PCOS的ROC曲線。與對(duì)照組比較，***P<0.001

三、轉(zhuǎn)染antagomir后KGN細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)水平變化

與空白組相比，KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染antagomir和antagomir control 24 h后，細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色熒光蛋白表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染效果良好(圖2A)?？瞻捉M、antagomir control及antagomir組中miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)水平分別為(1.0±0.21)、(1.05±0.16)及(0.17±0.19)，組間比較具有顯著性差異(F=29.29，P<0.001)。與空白組和antagomir control組相比，antagomir組中miR-9-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)(圖2B)。

A：KGN轉(zhuǎn)染效果鑒定；B：miR-9-5p在各組KGN內(nèi)的表達(dá)情況。與空白組及antagomir control組比較，***P<0.001

四、miR-9-5p對(duì)KGN增殖能力的影響

MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后KGN在不同時(shí)間段增殖情況，結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞在0、24、48及72 hOD值分別為(0.24±0.025)、(0.40±0.032)、(0.76±0.058)及(0.95±0.077)；antagomir control組細(xì)胞在0、24、48及72 h OD值分別為(0.24±0.025)、(0.38±0.029)、(0.77±0.049)及(0.91±0.073)；antagomir組細(xì)胞在0、24、48及72 h OD值分別為(0.24±0.025)、(0.31±0.034)、(0.65±0.051)及(0.79±0.066)，組間比較有顯著性差異(F=11.85，P<0.001)。與空白組、antagomir control組相比，antagomir組細(xì)胞在24、48、72 h增殖能力顯著降低(P<0.001)(圖3A)?？瞻捉M細(xì)胞在G0/G1、S及G2/M期的比例分別為(48.56±5.78)、(27.44±3.26)、(24.0±3.09)；antagomir control組細(xì)胞在G0/G1、S及G2/M期的比例分別為(50.0±6.44)、(26.18±3.97)、(23.82±2.60)；antagomir組細(xì)胞在G0/G1、S及G2/M期的比例分別為(61.23±7.48)、(16.68±2.05)、(22.09±3.72)，組間比較差異有顯著性(F=5.91，P=0.003)。與空白組及antagomir control組相比，antagomir組細(xì)胞中G0/G1期比例增加，而S期細(xì)胞比例減少(P<0.001)(圖3B)。

A：轉(zhuǎn)染后KGN在不同時(shí)間段增殖情況(MTT法)；B：轉(zhuǎn)染后KGN細(xì)胞周期的變化與空白組及antagomir control組比較，***P<0.001

五、miR-9-5p靶基因的預(yù)測(cè)驗(yàn)證

采用TargetScan Human 7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-9-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)AR mRNA 3’-UTR中“ACCAAAG”序列與miR-9-5p中“UGGUUUC”種子序列完全互補(bǔ)配對(duì)，提示AR可能為miR-9-5p靶基因(圖4A)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染重組載體AR-wt后，空白、antagomir control及antagomir組相對(duì)熒光素酶活性分別為(1.0±0.18)、(1.13±0.20)、(3.65±0.69)，組間比較有顯著性差異(F=31.60，P<0.001)。與空白及antagomir control組相比，antagomir組中相對(duì)熒光素酶活性升高(P<0.001)(圖4B)。

當(dāng)轉(zhuǎn)染重組載體AR-mut后，空白、antagomir control及antagomir組相對(duì)熒光素酶活性分別為(1.0±0.11)、(1.04±0.15)、(0.95±0.23)，3組比較無顯著性差異(F=1.78，P=0.52)(圖4B)。WB結(jié)果顯示，空白、antagomir control及antagomir組細(xì)胞中AR蛋白的表達(dá)水平分別為(1.0±0.13)、(0.92±0.08)、(6.44±0.71)，3組比較有顯著性差異(F=43.41，P<0.001)。與空白及antagomir control組相比，antagomir組細(xì)胞中AR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)(圖4C)。

A：AR mRNA 3’-UTR與miR-9-5p的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)；B：熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果；C：WB分析AR蛋白的表達(dá)水平變化。與空白及antagomir control組比較，***P<0.001

討 論

PCOS是一種代謝與內(nèi)分泌異常疾病，是女性不育的重要原因之一[1]。近幾十年來，盡管研究者做了大量關(guān)于PCOS的相關(guān)探究，但該病發(fā)生的確切原因尚不清楚。由于雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜組織的長(zhǎng)期刺激，PCOS患者可增加腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)[16]。因此完全有必要系統(tǒng)地探索PCOS的發(fā)病機(jī)理，并為其治療提供新的方案。miRNAs是一種小分子RNA，在進(jìn)化中高度保守，參與人體的正常生長(zhǎng)、代謝和發(fā)育，在多種生理過程中也起著關(guān)鍵作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在多種疾病狀態(tài)下異常表達(dá)，并被認(rèn)為是疾病的重要治療靶點(diǎn)[17]。目前，已發(fā)現(xiàn)許多miRNAs在PCOS中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，并參與PCOS的病理形成過程[18]。例如，miR-324在PCOS患者卵巢組織和KGN中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-324通過誘導(dǎo)凋亡而抑制KGN細(xì)胞活力[19]。低表達(dá)的miR-16在PCOS中促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖并抑制凋亡，miR-125b亦可調(diào)節(jié)PCOS中KGN增殖[20]。另一項(xiàng)研究報(bào)道，miR-483在PCOS患者中表達(dá)下調(diào)并降低KGN增殖[21]。本研究評(píng)估了患有PCOS血清中miR-9-5p的表達(dá)水平，特別是矯正了患者的年齡和BMI，并發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在PCOS患者血清中表達(dá)上調(diào)。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)干擾miR-9-5p通過抑制細(xì)胞周期G1到S期的轉(zhuǎn)變而抑制KGN增殖，提示miR-9-5p具有促進(jìn)KGN增殖的作用。

在人類基因組中，miR-9從三個(gè)獨(dú)立的基因組位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄分別映射到染色體1q22(miR-9-1)、5q14.3(miR-9-2)和15q26.1(miR-9-3)，這些轉(zhuǎn)錄本最終產(chǎn)生了功能成熟的miR-9-5p。越來越多的證據(jù)表明，miR-9-5p通過調(diào)控細(xì)胞增殖而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22]。此外，Wang等[23]發(fā)現(xiàn)血清miR-9-5p表達(dá)與細(xì)胞因子和趨化因子水平顯著相關(guān)，可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物。Ylmaz等[24]報(bào)道血清中miR-9-5p表達(dá)下調(diào)與阿爾茨海默氏病患病風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。S?rensen等[25]發(fā)現(xiàn)腦脊液中miR-9-5p可能是新的急性缺血性腦卒中診斷標(biāo)志物。近年來，研究者亦發(fā)現(xiàn)一些miRNAs可作為新的診斷PCOS的分子標(biāo)志物。Jiang等[26]發(fā)現(xiàn)血清miR-21可能提示PCOS進(jìn)展，并可以作為新型診斷PCOS的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物。Song等[27]證實(shí)血清miR-6767-5p是新型診斷PCOS的分子生物學(xué)標(biāo)志物，并且可能參與PCOS代謝。本研究采用ROC曲線發(fā)現(xiàn)血清miR-9-5p表達(dá)對(duì)PCOS的診斷具有較高的特異度及敏感度，提示miR-9-5p可能是一種新的PCOS診斷標(biāo)志物。正如前面報(bào)道的一樣，本研究不僅證實(shí)了miR-9-5p在PCOS中異常表達(dá)，并為PCOS診斷標(biāo)志物提供了新的成員。

越來越多的報(bào)告表明，miRNAs可以與靶基因的3′-UTR結(jié)合并在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。由于雄激素作用通過AR介導(dǎo)，因此AR介導(dǎo)的作用與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)。動(dòng)物模型研究顯示，AR的全身治療可誘發(fā)PCOS樣臨床特征；而使用AR拮抗劑氟他胺治療可恢復(fù)某些PCOS患者的正常排卵，并在PCOS小鼠模型中挽救無懷孕和類似焦慮的行為[28]。此外，AR信號(hào)缺失可保護(hù)雌性小鼠免于產(chǎn)前高雄激素血癥引起的PCOS[29]。據(jù)報(bào)道，AR是前列腺癌和膀胱癌中miR-381[30]和miR-449a[31]的直接靶標(biāo)。此外，越來越多的研究表明，AR在卵巢KGN異常增殖中起著重要作用[32]。與上述結(jié)果一致，我們的研究進(jìn)一步證明AR是KGN細(xì)胞中miR-9-5p的直接靶標(biāo)，miR-9-5p可直接與AR mRNA 3’-UTR互補(bǔ)結(jié)合而降低KGN中AR蛋白的表達(dá)水平。該結(jié)果表明，miR-9-5p通過直接調(diào)控AR而促進(jìn)KGN增殖進(jìn)而影響PCOS的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在PCOS患者血清中表達(dá)上調(diào)，推測(cè)可能是一種新的PCOS診斷標(biāo)志物。在機(jī)制上，miR-9-5p通過直接調(diào)控AR而促進(jìn)KGN增殖。