謝雅貞,陸啟濱
(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)太倉附屬醫(yī)院,太倉 215400;2.江蘇省中醫(yī)院,南京 210029)
復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(Recurrent Spontaneous Abortion,RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)2次或2次以上在妊娠20周內(nèi)的胎兒丟失,是流產(chǎn)類的疑難病,其發(fā)病率有逐年上升趨勢,嚴(yán)重危害婦女的生殖及心理健康[1]。研究表明,大約1%~3%正常生育的健康婦女和超過15%的RSA患者抗心磷脂抗體(Anticardiolipin antibody,ACA)陽性[2-4]??沽字贵w是一組針對(duì)各種帶負(fù)電荷磷脂的自身抗體的總稱,其中以心磷脂抗體(ACA)最具代表性,它的靶抗原是存在于細(xì)胞膜和線粒體膜中帶負(fù)電荷的心磷脂,為甘油磷脂類結(jié)構(gòu)。病理狀態(tài)下這類磷脂分布到細(xì)胞膜外,當(dāng)其與血清中的β2-糖蛋白1型結(jié)合后即暴露出抗原位點(diǎn),誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的自身抗體,即抗β2-糖蛋白1抗體[2-4]。ACA陽性患者體外受精率、妊娠率、著床率均明顯下降,流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)極高[2-4]。因此,ACA 所致的RSA在國內(nèi)外引起了廣泛關(guān)注,但目前對(duì)于其發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然不足。近年來,基于宏觀角度的蛋白組學(xué)和基因組學(xué)等組學(xué)分析成為研究疾病發(fā)生機(jī)制的重要方法,通過分析組間差異蛋白,可為探索疾病發(fā)生機(jī)制提供線索[5-7]。本研究應(yīng)用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)分析ACA陽性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠胎盤組織中蛋白表達(dá)譜特征并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為下一步探討ACA陽性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制和篩選治療靶點(diǎn)提供參考依據(jù)。
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性和雌性BALB/c小鼠(SPF級(jí))各20只,雌性8周齡,體重25±2 g,雄性8~10周齡,體重30±2 g。小鼠由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0001,合格證號(hào):No.201902211)。SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)全營養(yǎng)飼料由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場提供。
2.主要試劑和儀器:人β2GPI,購自ProSpec公司;BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo Fisher公司;小鼠ACA ELISA試劑盒,購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司;RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司;抗體HIF-1α(14179)、TLR4(14358)、TSP-1(37879)、Tim-3(83882)、RORγt(16540)和β-actin(5174)均為兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology,美國);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(sc-2004,Santa Cruz,美國)。Eppendorf AG 22331 Hamburg冷凍離心機(jī)(Eppendorf,美國),SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices Corporation,美國),ChemDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad,美國),UV-2450型紫外分光光度計(jì)(島津,日本),ESI-MS/MS LTQ-Velos高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher,美國)。
1.小鼠模型建立:將雌性實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照組和模型組,每組10只。人β2-糖蛋白I(β2-GPI)用無菌PBS調(diào)整濃度為400 μg/ml。模型組第1天腹腔注射人β2-GPI溶液與完全弗氏佐劑(CFA)混合液50 μl(1∶1比例),第8天注射人β2-GPI與不完全弗氏佐劑(IFA)混合液50 μl(1∶1比例),正常對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)注射生理鹽水50 μl;至第18天兩組雌性小鼠與雄性小鼠1∶1合籠,自合籠之日起,每天8:00和14:00點(diǎn)分別觀察一次,以見到陰栓為妊娠第0天。
2.動(dòng)物處理及組織、血清收集:在妊娠第15天時(shí),10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉,頸動(dòng)脈采血,2 000g離心15 min取上清,-80℃保存?zhèn)溆?。采血后頸椎脫臼法處死孕鼠,取胎盤、胎鼠進(jìn)行稱重,取出子宮,記錄吸收胎個(gè)數(shù)和存活胎個(gè)數(shù)。胚胎吸收率按以下公式計(jì)算:胚胎吸收率=吸收胎個(gè)數(shù)/(吸收胎個(gè)數(shù)+存活胎個(gè)數(shù))×100%。血清、胎盤中ACA含量按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行。
3.蛋白樣品收集處理:按組織樣品:裂解液=10 mg∶80 μl的比例,加入RIPA強(qiáng)裂解液,用剪刀剪碎組織,使用組織破碎儀破碎組織(中強(qiáng)度,每次轉(zhuǎn)3 s,停3 s,重復(fù)3次),于冰上放置15 min后,12 000g4℃離心15 min,取上清于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
4.蛋白凝膠電泳分離:樣品濃度測定參考BCA法。每個(gè)樣品取25 μg,采用12% SDS-PAGE 進(jìn)行分離;分離后的凝膠采用考馬斯亮蘭染色法進(jìn)行染色,染色后的凝膠Image Scanner 掃描儀進(jìn)行掃描。
5.差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析:每組取3只小鼠的胎盤組織進(jìn)行Label-free蛋白組學(xué)分析,蛋白還原烷基化、酶解及LC-MS/MS上機(jī)檢測和蛋白搜庫由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。
6.生物信息學(xué)分析:生信分析數(shù)據(jù)處理主要用Python軟件。利用R語言ggplot2軟件包和pheatmap軟件包分別繪制差異蛋白的火山圖和聚類熱圖,利用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析,分析差異蛋白的細(xì)胞成分、分子功能及生物學(xué)過程;利用KEGG pathway對(duì)差異蛋白富集的信號(hào)通路進(jìn)行功能注釋分析,通過StringDB蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。
7.差異蛋白的Western Blot驗(yàn)證:蛋白上樣量為40 μg,12%SDS-PAGE,100 V恒壓 1 h,濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(95 mA,75 min),用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h,加入HIF-1αTLR4TSP-1 Tim-3RORγtβ-actin一抗抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜,含0.5%Tween 20的TBS洗膜3次,每次10 min,加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶3 000稀釋),37℃孵育2 h,洗膜同上,加ECL發(fā)光顯色液,室溫反應(yīng)2 min后于暗室曝光。采用Image J軟件處理western blot條帶,分析各組條帶灰度,計(jì)算與內(nèi)參蛋白β-actin比值。
本文成功構(gòu)建ACA陽性流產(chǎn)小鼠模型。與正常對(duì)照組相比,模型組胎鼠重量、胎盤重量顯著下降(P<0.05);胚胎丟失率、血清和胎盤中ACA含量均顯著升高(P<0.05)(表1)。
表1 兩組小鼠胚胎大體差異比較
正常對(duì)照組和ACA模型組各取3只小鼠提取胎盤組織蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE分離,考馬斯亮藍(lán)染色后顯示,兩組樣品的蛋白質(zhì)遷移帶清晰,平行度較好,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求(圖1)。
M:Marker;1-3:正常對(duì)照組;4-6:ACA模型組
通過非標(biāo)記定量技術(shù)質(zhì)譜分析,獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖總數(shù)為585 740,鑒定到的肽段數(shù)目為40 331,蛋白數(shù)為4 338,部分肽段質(zhì)譜圖如圖2。以差異倍數(shù)大于或等于1.5 倍(上調(diào)或下調(diào))且P值(T-test檢驗(yàn))<0.05作為標(biāo)準(zhǔn),與正常對(duì)照組相比,ACA模型組小鼠胎盤組織中顯著上調(diào)的蛋白數(shù)為35,顯著下調(diào)的蛋白數(shù)為52。差異蛋白火山圖如圖3A所示,差異蛋白熱圖如圖3B所示。
圖2 部分肽段質(zhì)譜圖
圖3 差異蛋白火山圖(A)和聚類熱圖(B)
GO富集分析結(jié)果顯示,差異蛋白質(zhì)在生物學(xué)過程方面主要與定位和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān);細(xì)胞組分方面主要位于細(xì)胞外區(qū);分子功能方面主要參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性調(diào)控(圖4)。
圖4 GO富集柱狀圖
據(jù)富集結(jié)果,繪制富集到的KEGG通路的氣泡圖(只展示前20的結(jié)果)(圖5),KEGG通路富集分析結(jié)果顯示:差異蛋白質(zhì)主要在代謝通路和磷脂酶D信號(hào)通路富集。
圖5 KEGG富集氣泡圖
利用String DB蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)進(jìn)行鑒定蛋白的相互作用分析,39個(gè)差異蛋白之間存在相互作用(圖6)。
紅點(diǎn)代表上調(diào)蛋白,藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)蛋白
選取已報(bào)道與RSA發(fā)生發(fā)展有關(guān)的低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR-4)、凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1,TSP-1)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3,Tim-3)以及維甲酸相關(guān)孤核受體γt(Retineic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma,RORγt)進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。結(jié)果顯示,ACA模型組小鼠胎盤組織中HIF-1α、TLR-4、TSP-1、Tim-3和RORγt 蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)(圖6),與質(zhì)譜分析結(jié)果一致。
注:與對(duì)照組比較,*P<0.05
合理可靠的動(dòng)物模型是疾病發(fā)病機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)。研究表明采用β2-GPI主動(dòng)免疫法可建造穩(wěn)定可靠的ACA陽性流產(chǎn)小鼠模型,β2-GPI注射入體內(nèi),打破了體內(nèi)的免疫耐受,促使機(jī)體產(chǎn)生β2-GPI抗體,形成抗原抗體復(fù)合物促使血液凝固,形成血栓,促使血管內(nèi)皮受到破壞,暴露磷脂結(jié)合位點(diǎn),誘導(dǎo)產(chǎn)生ACA[8-9]。β2-GPI主動(dòng)免疫法優(yōu)點(diǎn)主要包括:(1)與其它造模方法相比,此法更接近ACA形成的生理過程;(2)成功率高、模型穩(wěn)定;(3)操作簡單、耗時(shí)短、可避免其它因素的干擾[8-9]。本實(shí)驗(yàn)給予雌性小鼠β2-GPI后,孕鼠的胎鼠重量及胎盤重量均顯著降低,胚胎丟失率顯著升高,血清和胎盤ACA濃度顯著升高。提示造模成功,為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容。通過比較研究對(duì)象在生理、病理或外界條件刺激下蛋白質(zhì)的表達(dá)情況,來了解生物的調(diào)控機(jī)制[10]。近年來,非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究中蛋白質(zhì)表達(dá)、定性和定量分析的強(qiáng)有力工具[7,11]。本研究利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),在ACA陽性小鼠胎盤組織中共鑒定出87個(gè)差異蛋白,其中35個(gè)顯著上調(diào),52個(gè)顯著下調(diào)。GO富集分析結(jié)果顯示,差異蛋白主要定位于細(xì)胞外,參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性調(diào)控。KEGG富集結(jié)果表明,差異蛋白主要與代謝和磷脂酶D信號(hào)通路有關(guān)。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示,差異蛋白中有39個(gè)存在相互作用。這些生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,差異蛋白可能通過這些途徑與病理生理過程參與ACA陽性流產(chǎn)的發(fā)生。
文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白中與RSA發(fā)生發(fā)展有關(guān)的主要包括:HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt。我們利用Western blot檢測HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt在兩組小鼠胎盤組織的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組相比,它們在ACA模型組中表達(dá)均升高,與蛋白組學(xué)結(jié)果相一致,提示本蛋白組學(xué)結(jié)果可信。HIF-1α在胎盤絨毛中的表達(dá)上調(diào)被證明與RSA有關(guān)[12]。研究表明TLR4在ACA陽性RSA發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,可能是通過調(diào)控COX-2等細(xì)胞因子水平從而導(dǎo)致胚胎異常而引起病理妊娠,最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[13]。李俠等[14]研究發(fā)現(xiàn),TSP-1的異常表達(dá)可使胎盤的血液供應(yīng)無法正常進(jìn)行,影響胚胎發(fā)育,導(dǎo)致流產(chǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)Tim-3在RSA 的外周血和蛻膜組織中的高表達(dá)與RSA 的發(fā)生發(fā)展有關(guān),RSA 患者血清中可溶性Tim-3(sTim-3)和Gal-9 表達(dá)增加,表明可溶性共刺激分子sTim-3 可能參與RSA 患者Th1和Th2 細(xì)胞的分化調(diào)控,使Th1/Th2 平衡偏向Th1,其機(jī)制可能為sTim-3與Gal-9 結(jié)合后削弱Tim-3/Gal-9 信號(hào)通路,傳遞抑制信號(hào),從而參與RSA 的發(fā)生發(fā)展[15-18]。RORγt在母-胎界面表達(dá)上調(diào)影響Treg/Th17分化、生成,使免疫平衡向Th17細(xì)胞方向移動(dòng),從而破壞免疫耐受,導(dǎo)致RSA發(fā)生[19]。雖然如此,但有關(guān)HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt與ACA陽性RSA的關(guān)系及具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究明確。
總之,本研究用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)揭示了ACA陽性流產(chǎn)小鼠胎盤組織中蛋白組學(xué)變化特征,初步分析了差異蛋白涉及的生物學(xué)功能和信號(hào)通路,為進(jìn)一步探討ACA陽性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制和篩選治療靶點(diǎn)提供線索。