集胞藻PCC 6803類鐵氧還蛋白Slr1205的功能研究

董杰,張昊,張芃芃

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

藍藻是結(jié)構(gòu)最簡單的放氧光合生物，是真核藻類和植物葉綠體的祖先[1]，因而作為光合作用研究的模式物種之一，集胞藻PCC 6803 (Synechocystissp. PCC 6803)是最早完成測序的光合生物[2]。它不僅能夠利用空氣中的二氧化碳自養(yǎng)生長，而且可以在添加外源葡萄糖時進行混合營養(yǎng)和異養(yǎng)生長。除了光合作用以外，藍藻還可以利用呼吸作用的氧化磷酸化產(chǎn)生能量用于生命活動。藍藻的呼吸作用主要是在黑暗中發(fā)揮功能，在藍藻中，NAD(P)H脫氫酶 (NDH-1復合體) 具有不同亞基組成形式，并參與多種生物功能。其中的NDH-1L與細胞呼吸直接相關，對Synechocystissp. PCC 6803利用葡萄糖光異養(yǎng)生長至關重要[3]，NDH-1M和NDH-1S參與CO2的濃縮吸收，有研究發(fā)現(xiàn)，NDH-2在Synechocystissp. PCC 6803中對光合作用和呼吸作用起調(diào)節(jié)作用[4]；琥珀酸脫氫酶(SDH)，即復合體Ⅱ，對藍藻呼吸電子傳遞非常重要[5]。

鐵氧還蛋白 (ferredoxin，F(xiàn)d)是廣泛分布于細菌、藻類和高等植物中的小分子可溶性鐵硫蛋白，其分子量約為11 kD。Fd的鐵硫中心為[2Fe-2S]、[3Fe-4S]和[4Fe-4S]，可作為電子載體傳遞電子。Fd與光合作用關系密切，它不僅通過與Fd-NADP+氧化還原酶 (FNR) 作用形成NADPH參與線性光合電子傳遞鏈，而且通過PGR5-PGRL1和NDH復合體參與循環(huán)電子傳遞[6]。在細菌中，F(xiàn)d是固氮酶[7]、氫酶、丙酮酸-Fd-氧化還原酶[8]的電子供體，參與氮代謝、氫代謝和呼吸作用。

Synechocystissp. PCC 6803中有9個fd基因，分別編碼9個不同的鐵氧還蛋白，這9個Fd蛋白在集胞藻屬(Synechocystis)、魚腥藻屬(Anabaena)、柱胞藻屬(Cylindrospermum)、念珠藻屬(Nostoc)等藍藻中都是保守的[9]。其中Fd1蛋白在植物和藻類中含量豐富，是光合作用所必需的鐵氧還蛋白。Synechocystissp. PCC 6803的fd1基因在葡萄糖存在下對細胞的生長也是至關重要的，在沒有光合作用的情況下，F(xiàn)d1吸收葡萄糖的碳源，為藻株的細胞生長提供能量[10]。與fd1類似，fd2、fd3、fd6和fd8基因編碼的Fd蛋白對Synechocystissp. PCC 6803的光合自養(yǎng)生長也是必不可少的[9]，而Fd4[11]、Fd5[12]、Fd7[13]和Fd9對Synechocystissp. PCC 6803的自養(yǎng)生長不是必需的。Fd4和Fd5缺失對藻株的生長情況沒有太大的影響，F(xiàn)d7和Fd9在耐氧化和金屬脅迫中起著重要作用，F(xiàn)d7的[2Fe-2S]中心在抵抗缺鐵脅迫過程中至關重要[9]。

Ferredoxin-like蛋白是與Ferredoxin蛋白序列的同源蛋白，它們通常具有小亞基或β-亞基的組合型呼吸系統(tǒng)復合物的功能，例如大腸桿菌中的硝酸還原酶 (NarH蛋白)、氫氧化酶-2 (HybA)[14]，還有一些在大腸桿菌中已知的Fd-like蛋白是特定的呼吸酶產(chǎn)生活性所必需的[15]。在植物中，F(xiàn)d-like蛋白的表達可以增強光合作用中碳的積累，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)d-like蛋白的表達能通過調(diào)節(jié)光合作用效率提高轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)量[16]。

雖然已有研究對細菌和高等植物中Fd-like蛋白的功能有了一定的認識，但藍藻中Fd-like蛋白的功能還完全未知。因此本研究選擇Synechocystissp. PCC 6803中的Fd-like蛋白開展生理功能研究，期望通過構(gòu)建編碼Fd-like蛋白基因敲除突變株Δslr1205，探索不同條件下Fd-like蛋白在光合作用和呼吸作用中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1實驗材料Synechocystissp. PCC 6803葡萄糖耐受性藻株 (WT) 來自本實驗室。免疫缺陷型大腸桿菌菌株Trans5α購自北京全式金生物技術有限公司，用于質(zhì)粒載體構(gòu)建克隆。

1.1.2實驗試劑 TURBO DNA-freeTM Kit，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司，Trans Start Top Green qPCR SuperMix、TaqDNA聚合酶購自全式金公司，Q5高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購自NEB公司，DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自TIANGEN公司。AtpB抗體購自Agrisera公司，NdhK抗體由上海師范大學馬為民教授贈送。

1.2 實驗方法

1.2.1藻株培養(yǎng) 本實驗參照Zhang等[3]的培養(yǎng)條件對藻株進行培養(yǎng)。Synechocystissp. PCC 6803 WT和Δslr1205是用液體或固體BG-11培養(yǎng)基在4 100 K色溫的LED光源下培養(yǎng)。本研究的標準培養(yǎng)條件為自養(yǎng)：30℃、50 μmol·photons·m-2·s-1光強的連續(xù)光照、空氣水平的二氧化碳 (LC)，對比條件有：高碳自養(yǎng) (3%二氧化碳，HC)、混合營養(yǎng) (+5 mmol·L-1葡萄糖)、光異養(yǎng) (+ 5 mmol·L-1葡萄糖和10 μmol·L-1DCMU)、周期光 (2 h光照2 h黑暗)。

1.2.2突變株的構(gòu)建和藍藻的轉(zhuǎn)化篩選 將卡那霉素抗性基因編碼區(qū)序列插入pUC18的SmaⅠ位點，構(gòu)建克隆載體pUC-Kn。以Synechocystissp. PCC 6803 WT的基因組DNA為模板，分別用pUC-slr1205-up-R-BamHⅠ、pUC-slr1205-up-F和pUC-slr1205-down-R-KpnⅠ、pUC-slr1205-down-F-KpnⅠ引物擴增slr1205的上游和下游序列并包含部分slr1205編碼區(qū) (表1)，分別連入pUC-Kn中卡那霉素抗性基因的兩側(cè)。利用自然轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的載體導入Synechocystissp. PCC 6803 WT中，在含有卡那霉素抗性的BG-11平板上挑取陽性單克隆，劃線培養(yǎng)3代以上，通過PCR驗證轉(zhuǎn)化子的基因型。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers for the study

1.2.3藍藻總RNA的提取和q-RT-PCR 收集20 mL OD750=0.8～1時的藻細胞，利用Trizol (Invitrogen) 法提取總RNA，經(jīng)DNase (Ambion Turbo DNase kit) 消化去除基因組DNA[17]。從純化的2 μg總RNA合成首條單鏈cDNA (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)。特異擴增fd1和slr1205引物 (表1) 用于定量分析基因的轉(zhuǎn)錄水平。編碼RNA酶P的基因rnpB作為持家基因用于定量分析的內(nèi)參，所有的擴增產(chǎn)物為150～200 bp。qRT-PCR使用SYBR Green熒光定量試劑盒在ABI life熒光定量PCR儀上進行。采用2-ΔCt的算法計算基因的相對表達含量。

1.2.4光合和呼吸活性檢測 用Hansatech Clorolab 2液相氧測定系統(tǒng)檢測自養(yǎng)、混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)的Δslr1205和WT藻細胞的飽和凈光合活性和黑暗下的呼吸活性[18]。藻細胞以葉綠素濃度10 μg·mL-1重懸于新鮮的培養(yǎng)液中，在樣品池中加入1 mL細胞懸液進行測定，每個樣品做3次生物學重復。

1.2.5葉綠素及類胡蘿卜素含量測定 使用100%的甲醇在黑暗中萃取Δslr1205和WT藻細胞或者類囊體膜中的脂溶性色素，離心去除碎片的上清在分光光度計中測定特定波長的吸光值，通過如下公式計算葉綠素a和類胡蘿卜素濃度[19]。

Chla=12.61 × (A665-A750) ×n

Car=[(A470- A750) × 1 000 - 20.56 × (A665- A750)]/221 ×n

其中，Chla為葉綠素a的濃度，Car為類胡蘿卜素的濃度，單位為μg·mL-1；A665為665 nm處的吸光值，A750為750 nm處的吸光值，A470為470 nm處的吸光值。

1.2.6膜蛋白分離 類囊體膜蛋白樣品的分離方法參照Zhang 等[3]的方法。所有步驟均在4 ℃下避光進行。簡要的過程為：收集OD750為0.5～1.0的藻細胞，采用玻璃珠法進行細胞破碎，低速離心去除玻璃珠和細胞碎片，上清液經(jīng)過高速離心沉淀類囊體膜。對重懸的膜蛋白樣品測定蛋白質(zhì)濃度和葉綠素濃度。

1.2.7蛋白電泳與免疫印跡 實驗步驟參考Tyystj?rvi等[20]的方法，變性蛋白樣品 (5 μg蛋白) 采用含有6 mol·L-1尿素的濃度為12%的SDS-PAGE分離，并通過銀染顯色[21]或者通過NdhK和AtpB特異性抗體免疫檢測。膜蛋白復合體通過4.5%～12%的藍綠膠電泳(BN-PAGE)分離，上樣量為2 μg葉綠素，通過NdhK特異性抗體免疫檢測。

1.2.8生物信息學分析 在UniProt網(wǎng)站 (https://www.uniprot.org/) 檢索Synechocystissp. PCC 6803中編碼Fd蛋白的基因并獲取氨基酸序列，通過NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 的比對工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 查找Synechocystissp. PCC 6803中與Fd1氨基酸序列同源的蛋白序列，并用MEGA6構(gòu)建Fd1-9和與Fd1同源性高的蛋白序列的進化樹，在CyanoExpress網(wǎng)站 (http://cyanoexpress.sysbiolab.eu/) 提供的Synechocystissp. PCC 6803基因表達數(shù)據(jù)庫中檢索slr1205和fd1基因在不同實驗條件下的轉(zhuǎn)錄情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 集胞藻編碼Fd-like蛋白基因的確定

通過UniProt網(wǎng)站檢索和序列比對，我們確定了Synechocystissp. PCC 6803中的slr1205基因編碼Fd-like蛋白。除此之外，序列比對結(jié)果顯示Ssl3044和Ssr1041與Fd1的同源性較高，從進化樹結(jié)果來看，Slr1205與Fd8和Fd9的序列相似性較高，Ssr1041和Ssl3044與Fd5的序列相似程度最高 (圖1)，Ssl3044和Ssr1041注釋顯示與氫化酶有關，而氫化酶與呼吸作用密切相關，因此猜測

注：集胞藻6803 Fd家族蛋白的進化樹通過MEGA6.1進行構(gòu)建，Ruba為集胞藻6803紅素氧還蛋白 (Slr2033)，這里作為外群。Flda為集胞藻6803黃素氧還蛋白 (Slr0248)。圖1 集胞藻PCC 6803 Fd家族蛋白的進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Synechocystis PCC 6803 Fd family proteins

Fd-like蛋白可能參與Synechocystissp. PCC 6803的氫代謝和呼吸作用，本文將探索Slr1205在Synechocystissp. PCC 6803中的生物功能。

2.2 突變株鑒定

通過PCR對突變藻株的基因型進行鑒定，用Δslr1205對應的鑒定引物Δslr1205-R和Δslr1205-F分別擴增Δslr1205和WT的總DNA，結(jié)果顯示，Δslr1205只擴增出1條約為1.9 kb的條帶，對應的WT條帶約為1.3 kb(圖2)，說明突變株的slr1205基因已被敲除。

注：M為DNA分子量標準，左側(cè)數(shù)值顯示各條帶的大小。圖2 突變株的鑒定Fig.2 The identification of mutant

2.3 突變株和WT中fd1、slr1205基因的轉(zhuǎn)錄水平

通過qPCR檢測fd1、slr1205基因在WT和Δslr1205中的轉(zhuǎn)錄本，它們相對于內(nèi)參基因rnpB的表達量見圖3A。在WT中，fd1轉(zhuǎn)錄本的含量比slr1205高很多，約是后者的11倍。而且，Kn基因在Δslr1205中的表達量比slr1205基因在WT中的表達量低 (圖3B、D)，所以Kn基因?qū)ν蛔冎晟L無顯著影響，我們認為突變株的表型變化與Kn基因無關。fd1的轉(zhuǎn)錄本在Δslr1205中的含量比在WT中低 (圖3C)。slr1205的轉(zhuǎn)錄本在Δslr1205中幾乎檢測不到 (圖3D)，這也說明突變株已完全敲除了slr1205基因。

2.4 突變株表型的探索

為了確定初步摸索測試的條件，在CyanoExpress網(wǎng)站 (http://cyanoexpress.sysbiolab.eu/) 對slr1205基因表達情況進行了分析。由于fd1基因在Synechocystissp. PCC 6803中是必不可少的，所以我們以fd1基因做對照，引入表達分析(表2)。數(shù)據(jù)顯示了不同條件下集胞藻PCC 6803 WT中基因在RNA水平的表達變化，數(shù)據(jù)庫中包括了RNA-Seq和基因芯片的測試結(jié)果。相對于fd1、slr1205在低溫、缺鐵以及缺少無機元素碳、氮、磷時表達上調(diào)，根據(jù)實驗室條件首先選擇了不同濃度二氧化碳條件進行測試，觀察突變株的生長表型。

A： fd1、slr1205在WT中相對于內(nèi)參基因rnpB的表達量；B：Kn基因在WT、Δslr1205中的相對表達量；C： fd1基因在WT、Δslr1205中的相對表達量；D： slr1205基因在WT、Δslr1205中的相對表達量。圖3 Δslr1205和WT中fd1、slr1205基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcription levels of fd1 and slr1205 genes in Δslr1205 and WT

表2 基因在不同脅迫條件下的表達情況Table 2 Gene expression in different stress conditions

2.5 不同二氧化碳濃度條件下突變株和WT的自養(yǎng)生長情況

分別在空氣水平CO2(LC) 濃度和高CO2(HC) 濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)WT和突變株，溫度、光照強度、光照時間等其他條件均為正常培養(yǎng)條件。通過藻液的光密度生長曲線發(fā)現(xiàn)：在HC條件下培養(yǎng)時，Δslr1205比WT生長緩慢；而LC條件下培養(yǎng)時， WT和Δslr1205生長速度基本沒有區(qū)別。兩種條件下Δslr1205的藻液顏色比WT的偏黃 (圖4)，實驗重復3次，趨勢相同。

2.6 不同營養(yǎng)條件下突變株和WT的生長情況

如圖5所示，先采用連續(xù)光照，分別用無添加 (自養(yǎng))、添加葡萄糖 (+G, 混合營養(yǎng))、添加葡萄糖和DCMU (+G+DCMU, 光異養(yǎng)) 的BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)WT和Δslr1205，對比生長情況發(fā)現(xiàn)：混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下Δslr1205生長速率比WT慢，特別是光異養(yǎng)條件下的表型更明顯。

如圖6所示,在周期光條件下突變株和WT在3種營養(yǎng)狀態(tài)下的生長表型與連續(xù)光照下相似，只是突變株與WT的差異更大。所有培養(yǎng)條件下，突變株藻液均比WT偏黃。實驗重復了3次，趨勢相同。

2.7 突變株的光合作用和呼吸作用活性

由于突變株的生長速率發(fā)生了變化，我們測定了自養(yǎng)、混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下培養(yǎng)的藻細胞的凈光合作用和呼吸作用活性 (表3)，結(jié)果表明：自養(yǎng)條件下Δslr1205的凈光合和呼吸活性與WT相差不多，而混合營養(yǎng)條件下突變株的相應速率都明顯低于WT；光異養(yǎng)條件下Δslr1205的呼吸活性也低于WT。

圖4 Δslr1205和WT在不同濃度二氧化碳條件下的生長情況Fig.4 Growth of Δslr1205 and WT cultured at different CO2 level

圖5 連續(xù)光照下Δslr1205和WT在補充有機碳源條件下的生長情況Fig.5 Growth of Δslr1205 and WT cultured in organic carbon supply under continuous light conditions

圖6 周期光下Δslr1205和WT在補充有機碳源條件下的生長情況Fig.6 Growth of Δslr1205 and WT cultured in organic carbon supply under photoperiod

2.8 突變株類胡蘿卜素和葉綠素的含量

由于在各種培養(yǎng)條件下Δslr1205藻液的顏色均比WT偏黃，我們測定了自養(yǎng)、混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)生長的WT和Δslr1205藻細胞中類胡蘿卜素和葉綠素的濃度，并計算類胡蘿卜素與葉綠素濃度的比值(表4)。結(jié)果顯示，3種營養(yǎng)條件生長的Δslr1205的類胡蘿卜素的相對含量均比WT有明顯升高。

2.9 突變株類囊體膜上主要光合蛋白的積累情況

由于突變株Δslr1205的光合和呼吸活性發(fā)生了明顯變化，我們通過SDS-PAGE和Western blot等生物化學方法對突變株和WT在自養(yǎng)、混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下類囊體膜蛋白的積累情況進行分析。從銀染的SDS-PAGE膠圖(圖7)來看，分別比較3種營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的突變株和WT，高豐度膜蛋白的表達并無明顯差異。利用Western blot檢測NDH-1復合體的表達情況發(fā)現(xiàn)：在自養(yǎng)條件下，突變株中NdhK的含量與WT基本相同，而在混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下的含量則明顯少于WT(圖7)，這與Δslr1205的呼吸活性(表3)和生長速率(圖5)都低于WT是一致的。ATP合成酶蛋白亞基AtpB作為Western blot的內(nèi)參，突變株和WT之間無明顯差異。

表3 Δslr1205和WT細胞的凈光合和呼吸活性 Table 3 Net photosynthesis and respiratory activity of Δslr1205 and WT cells /(μmolO2·mg-1Chl·h-1)

表4 不同條件下培養(yǎng)的藻細胞類胡蘿卜素/葉綠素的相對含量Table 4 The ratio of carotenoids/chlorophyll in the cells grown under different conditions

2.10 突變株和WT不同類型NDH-1復合體的積累情況

圖7顯示，Δslr1205在混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下的NdhK蛋白明顯減少。由于藍藻具有多種不同形式和功能的NDH-1復合體，SDS-PAGE無法區(qū)分它們，因此，我們采用BN-PAGE結(jié)合Western blot進一步分析不同形式的NDH-1復合體在WT和Δslr1205中的積累情況。結(jié)果表明，在自養(yǎng)條件下，參與CO2吸收的NDH-1M含量較多，NDH-1L較少，突變株與WT之間并沒有明顯差異。在光異養(yǎng)條件下 (+G+DCMU)，NDH-1L是主要的NDH-1復合體形式，二氧化碳的吸收被抑制，NDH-1M僅有極少量?；旌蠣I養(yǎng)條件下這兩種NDH-1復合體的含量介于自養(yǎng)和光異養(yǎng)之間。在含有葡萄糖時，Δslr1205中的NDH-1L復合體的含量明顯比WT少(圖8)，這與SDS-PAGE的Western-blot (圖7)結(jié)果是一致的。NDH-1L參與藍藻的呼吸作用，這也解釋了為何在含G條件下Δslr1205的呼吸活性比WT低。較低的呼吸活性很可能是Δslr1205的生長速率比WT慢的主要原因之一。

注：采用12%含有6 mol·L-1尿素的SDS-PAGE分離類囊體膜蛋白樣品，每條泳道的上樣量為5 μg蛋白，圖片自上而下分別為銀染的PAGE膠、AtpB和NdhK特異性抗體的免疫印跡。圖7 WT和Δslr1205在自養(yǎng)、混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下類囊體膜蛋白的積累Fig.7 Accumulation of thylakoid membrane proteins in the WT and Δslr1205 grown under autotrophic, mixotrophic and photoherterotrophic conditions

3 討論

通過觀察在多種培養(yǎng)條件下的WT和Δslr1205的生長情況，我們發(fā)現(xiàn)在添加G和G+DCMU的BG-11培養(yǎng)基和高二氧化碳條件下培養(yǎng)的Δslr1205的生長速率均比WT慢，二氧化碳是藍藻光合自養(yǎng)的無機碳源，而葡萄糖是有機碳源。在碳源充足時，藍藻的生長速率也會隨之增加，但突變株的增幅卻小于WT，我們將對產(chǎn)生這一現(xiàn)象的可能原因進行分析。

3.1 Slr1205蛋白影響藻株的生長速率

在本研究構(gòu)建的Δslr1205中幾乎檢測不到slr1205基因的mRNA，說明該藻株是完全敲除突變株，適宜用于Slr1205蛋白功能的研究。從WT中fd1和slr1205的轉(zhuǎn)錄情況發(fā)現(xiàn)，slr1205基因的轉(zhuǎn)錄水平比fd1低，約是fd1的14%。通過qPCR的鑒定，我們發(fā)現(xiàn)fd1基因在Δslr1205中的轉(zhuǎn)錄水平有所下降，F(xiàn)d1蛋白是藍藻進行光合作用所必需的蛋白，參與光合線性電子傳遞最后一步還原力NADPH的產(chǎn)生。它的表達量降低，可能直接影響了Δslr1205中NADPH的合成，進而影響藻株的合成代謝速率。Δslr1205中fd1基因下調(diào)可能是其生長速率降低的直接原因。類胡蘿卜素具有抗氧化作用，參與光合系統(tǒng)的保護功能[22]。

A: BN膠;B: NdhK抗體的免疫印跡。類囊體膜蛋白樣品采用BN-PAGE分離，每條泳道的上樣量為2 μg葉綠素。圖8 WT和Δslr1205在不同營養(yǎng)條件下的類囊體膜蛋白復合體Fig.8 Thylakoid membrane protein complexes of WT and Δslr1205 grown under different nutritional condition

突變株中的類胡蘿卜素上升可能是其應對光合活性改變的一種補償機制。

3.2 Slr1205蛋白影響藻株對碳元素的利用

本研究數(shù)據(jù)表明，無論是添加無機碳源CO2(HC自養(yǎng)) 還是添加有機碳源葡萄糖 (混合營養(yǎng)和光異養(yǎng))，Δslr1205均比WT生長慢。無機碳源是光合作用的底物，有機碳源葡萄糖是呼吸作用的底物。Δslr1205在混合營養(yǎng)條件下的凈光合速率和呼吸速率都明顯低于WT，說明敲除slr1205同時改變了藻株的光合作用和呼吸作用活性，這可能是突變株不能有效地利用碳源的原因之一。

3.3 Slr1205蛋白與藻株的呼吸作用有關

光合作用的光合磷酸化和呼吸作用的氧化磷酸化是光合生物兩大重要產(chǎn)能途徑。在光異養(yǎng)條件下，產(chǎn)能途徑只有光合循環(huán)電子傳遞和呼吸作用，Δslr1205的生長速率仍然比WT慢，這說明光合線性電子傳遞不是影響突變株生長的主要因素。在培養(yǎng)條件中進一步加入黑暗周期，Δslr1205與WT生長速率差異加大。由于黑暗下的產(chǎn)能途徑僅有呼吸作用，因此我們認為呼吸作用可能是導致Δslr1205生長緩慢的主要原因。藍藻的NDH-1復合體參與細胞呼吸，其中的NDH-1L復合體對于Synechocystissp. PCC 6803以葡萄糖為碳源的光異養(yǎng)生長至關重要[3]。在混合營養(yǎng)和光異養(yǎng)條件下，Δslr1205中的NDH-1L復合體含量明顯減少，這與Δslr1205的呼吸速率更低是一致的，說明Fd-like蛋白Slr1205對呼吸作用活性具有正調(diào)控作用。有些非光合細菌的Fd-like蛋白直接參與了呼吸作用[15]，本研究結(jié)果證明，F(xiàn)d-like蛋白的這方面功能在藍藻中也是保守的。

綜上研究，我們發(fā)現(xiàn)Synechocystissp. PCC 6803中的Fd-like蛋白Slr1205通過調(diào)控Fd1的表達量，保證了藍藻中NADPH正常合成，從而使得光合作用線性電子傳遞鏈正常進行和生物合成代謝所需還原力的積累。同時，通過調(diào)節(jié)呼吸電子傳遞鏈中的重要復合體NDH-1L參與呼吸作用，從而平衡藍藻中的能量代謝?？傊?，F(xiàn)d-like蛋白Slr1205主要通過調(diào)控呼吸作用維持Synechocystissp. PCC 6803能量代謝平衡，同時也通過調(diào)節(jié)Fd1和類胡蘿卜素含量影響藻株的光合作用和抗脅迫能力，起到優(yōu)化光合作用的功能，具體的作用機理還需要進一步深入研究。本研究的發(fā)現(xiàn)表明，平衡光合作用和呼吸作用活性有望作為光合生物增產(chǎn)抗逆的途徑之一。