基于16S rRNA高通量測序分析大瀧六線魚表皮粘液及腸道內(nèi)容物微生物多樣性

樊英,于曉清,李樂,王曉璐,葉海斌,胡發(fā)文,刁菁,劉洪軍

山東省海洋生物研究院, 山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室; 青島市海洋生物種質(zhì)資源挖掘與利用工程實驗室, 山東 青島 266104

魚表皮組織是機(jī)體抵御外界病原入侵的第一道防線，可參與滲透壓調(diào)節(jié)、信息傳遞、病害防御等重要生命活動[1]。在養(yǎng)殖系統(tǒng)中，由于自然的(如高溫、高溶解氧等)或人為的(分類、捕撈等)原因都可能給養(yǎng)殖動物帶來眾多威脅，對機(jī)體生理產(chǎn)生負(fù)面脅迫，進(jìn)而損害表皮組織系統(tǒng)，降低機(jī)體的存活率和對病害的抵抗力[2-3]。然而，魚表皮粘液是表皮組織與外界環(huán)境之間的粘膜屏障[4]。粘液中棲息著的大量微生物，時刻與環(huán)境、動物機(jī)體構(gòu)成生物、物理、免疫屏障，可通過免疫球蛋白、補(bǔ)體、溶菌酶等作用增加魚體抵抗病原菌侵入的能力[5]。有研究報道，金頭鯛(SparusaurataL.)表皮粘液中含有高水平的皮質(zhì)醇和IgM，可提高其對環(huán)境脅迫的抵抗能力[2]；鯽魚(Carassiusauratusgibelio)表皮粘液可顯著降低5×103CFU嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)對機(jī)體的侵入[6]；大菱鲆(Scophthalmusmaximus)體表粘液中的溶菌酶等水解酶類可通過溶解寄生物等作用來保護(hù)機(jī)體[7]；而且，魚類粘液中的凝集素可提高吞噬作用，同時作為免疫活性物質(zhì)提高機(jī)體的防御能力[8]。

魚腸道既是體內(nèi)主要的消化器官，又是機(jī)體病害防御的又一道防線[9]。在這一開放復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中同樣存在著大量的微生物，它們即是最簡單的生命體，又具有高等生物的基本生命過程，這些微生物參與著宿主的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)等功能的運(yùn)轉(zhuǎn)，與宿主之間建立了動態(tài)平衡關(guān)系，而且一般在幼魚階段隨腸道器官的發(fā)育成熟而達(dá)到穩(wěn)定[10-12]。腸道微生物菌群的穩(wěn)定性是魚類抵抗病原體感染的一個非常重要的因素。若腸道微生態(tài)平衡失調(diào)，機(jī)體正常生理功能就會發(fā)生紊亂，因此，了解魚類腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)將有助于了解疾病暴發(fā)前或期間所帶來的干擾[13]。近年來，腸道微生物基因組計劃逐步實施，宏基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)不斷發(fā)展，腸道微生物的研究備受關(guān)注[14-15]。樊英等[16]通過腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化來評價丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的影響；孫盛明等[17]通過腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化來研究甘露寡糖(mannan oligosaccharide, MOS)對團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)幼魚的影響；Zhao等[18]通過腸道有益內(nèi)源菌(如芽孢菌Bacilli、放線菌Actinobacterial)數(shù)量探討益生菌對九孔螺(Haliotisdiversicolor)的影響。

大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)，俗稱黃魚，素稱“北方石斑”，屬于鲉形目(Scorpaeniformes)、六線魚科(Hexagrammidate)、六線魚屬(Hexagrammos)，適于在水溫低于20 ℃、潔凈無污染的流動水環(huán)境中生長，常見于黃、渤海地區(qū)，因其營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值深受消費(fèi)者和養(yǎng)殖者的喜愛，具有良好的市場前景[19]。隨著人們生活水平的提高，魚類需求量逐漸增加，且在高集約化養(yǎng)殖環(huán)境下，細(xì)菌性疾病的發(fā)生頻率呈逐年上升趨勢，目前常見且集中研究的病原菌包括愛德華氏菌、副溶血性弧菌、哈維氏弧菌等[20-22]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，微生物菌群多樣性研究在健康養(yǎng)殖以及病害防控方面已有報道[23-26]，但關(guān)于大瀧六線魚表皮粘液及腸道內(nèi)容物中的微生物菌群研究還未見報道。因此，本實驗通過16S rRNA高通量測序技術(shù)分析大瀧六線魚表皮粘液及腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性，可為微生物基因功能預(yù)測奠定基礎(chǔ)，為水產(chǎn)品的安全性評價提供參考，更為分析病害發(fā)生機(jī)理和指導(dǎo)合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗大瀧六線魚及飼養(yǎng)條件 150尾大瀧六線魚來自青島魯海水產(chǎn)技術(shù)發(fā)展公司，游動活潑，體色光亮正常，食欲旺盛，未發(fā)現(xiàn)病癥，平均體質(zhì)量為(12.00±2.0)g。實驗共分3個平行組，每組150尾魚。養(yǎng)殖周期30 d。

實驗用基礎(chǔ)配合飼料來自北京漢業(yè)科技有限公司，其營養(yǎng)水平為粗蛋白質(zhì)471 g·kg-1、粗脂肪174 g·kg-1、粗灰分96 g·kg-1、可溶性膳食纖維5.91 g·kg-1、水解氨基酸404.4 g·kg-1、鈣1.521 0×104mg·kg-1、鐵808 mg·kg-1、鋅137 mg·kg-1、水分75.3 g·kg-1。

實驗在山東省海洋生物研究院養(yǎng)殖基地循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(3 m×1 m×1.2 m)中進(jìn)行。實驗過程中每天排污、吸除殘餌，每天分別在10:00、18:00投喂兩次，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%，根據(jù)攝食情況適當(dāng)調(diào)整投喂量，達(dá)到飽食投喂，無殘餌剩余，且飼喂餌料在2 h內(nèi)攝食完。實驗期間水溫為(12.5±1.0) ℃，溶解氧為(7.0±0.5) mg·L-1，pH為7.2±0.3，氨氮和亞硝酸氮含量<0.1 mg·L-1。

1.1.2試劑 E.Z.N.A.?Stool DNA Kit購自美國OMEGA公司；Axyprep PCR Cleanup Kit購自美國AXYGEN, Life Science Research公司；Biowest Agarose G-10購法國BIOWEST公司；Pusion Hot start fles 2X Master Mix購自上海儀濤生物儀器有限公司；50 ×TAE Buffer購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3儀器與設(shè)備 冷凍離心機(jī)購自美國BECKMAN公司；PCR儀購自美國BIO-RAD公司；電泳儀購自北京六一儀器有限公司；數(shù)碼凝膠成像儀購自美國SIM公司；超微量核酸蛋白分析儀購自五洲東方科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1樣品采集 對正常養(yǎng)殖期間大瀧六線魚進(jìn)行表皮粘液和腸道內(nèi)容物取樣。取樣前停食24 h，每組隨機(jī)挑取45尾魚，將無菌操作臺置于冰上進(jìn)行魚樣處理。魚表皮組織粘液樣品按照Guardiola[27]的方法進(jìn)行，即通過無菌細(xì)胞刮刀輕輕地刮擦背外側(cè)進(jìn)行收集，注意避免血液和泌尿生殖道及腸道排泄物的污染；收集的粘液樣品加入同體積的無菌海水進(jìn)行均化，劇烈搖動后4 ℃ 2 000 g離心10 min，上清液于-80 ℃保存(分別編號為HO_S：S1、S2、S3)、備測。隨后，用75%酒精將魚肛門及周邊表皮進(jìn)行消毒，用無菌解剖剪沿肛門向上、前呈弧形剪開，取出腸道；然后，先用75%酒精消毒腸道組織表面，再用無菌PBS緩沖液沖洗3次，無菌棉球擦拭干燥后將中后腸腸道內(nèi)容物置于無菌Eppendorf管中，-80 ℃保存(分別編號為HO_I：I1、I2、I3)、備測。本實驗將15尾魚的粘液或腸道樣品混合作為一個樣品進(jìn)行分析，以減少個體間變異的影響。

1.2.2基因組DNA提取、擴(kuò)增、純化 采用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit提取魚表皮粘液及腸道內(nèi)容物微生物總基因組DNA，按照操作說明方法進(jìn)行。提取得到的DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析其合格性，并由超微量核酸蛋白分析儀(Biodropsis BD-1000)測定其濃度，保存于-80 ℃作為模板使用。PCR反應(yīng)體系25 μL：基因組DNA模板50 ng，V3+V4區(qū)通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 各2.5 μL，Pusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5 μL，補(bǔ)水至25 μL；反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后，備測。

1.2.3高通量測序及分析 純化后的產(chǎn)物由杭州聯(lián)川生物有限公司通過文庫制備與庫檢后進(jìn)行Illumina MiSeq 2×300 bp paired-end上機(jī)測序。Miseq測序完成后，得到原始的下機(jī)數(shù)據(jù)，去除Reads的Barcode和接頭序列，利用Overlap將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，去除含有N(N表示無法確定堿基信息)的比例大于5%的tags，去除低質(zhì)量tags (質(zhì)量值Q<10的堿基數(shù)占整個tag的20%以上)，通過質(zhì)控和過濾后，獲得高質(zhì)量的Clean數(shù)據(jù)。對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行97%的相似度聚類，采用CD-HIT將序列相似性大于97%的clean tags定為一個OTU (operational taxonomy unit)，過濾后獲得最終的OTU豐度及代表序列，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析和差異分析等。分析數(shù)據(jù)庫包括RDP、Greengenes、NCBI 16S Microbial和Customized database。分析內(nèi)容包括原始數(shù)據(jù)優(yōu)化及有效優(yōu)質(zhì)序列統(tǒng)計、OTU Venn圖、Alpha多樣性指數(shù)分析、Beta多樣性PCoA分析、Rank-aboundance曲線分析、分類學(xué)豐度分析、物種差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rRNA測序的大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物菌群多樣性

2.1.1基于16S rRNA測序的大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物序列數(shù)據(jù)分析 對大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物的16S rRNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個樣本的有效序列如表1所示，腸道內(nèi)容物樣本中高質(zhì)量有效序列數(shù)量均超過30 000條，明顯多于表皮粘液樣本中有效序列數(shù)量，說明腸道內(nèi)容物樣本中的細(xì)菌豐富度高于表皮粘液樣本。根據(jù)97%的相似度進(jìn)行OTU分類，表皮粘液不同樣本OTU數(shù)目分別為13 051、12 202、17 436，其中注釋到數(shù)據(jù)庫的比例為99%以上；腸道內(nèi)容物不同樣本OTU數(shù)目分別為20 226、30 441、18 887，其中注釋到數(shù)據(jù)庫的比例為99%以上，其可操作分類單元數(shù)量高于表皮粘液樣本。這些結(jié)果均說明不同樣本測序數(shù)據(jù)量足夠大，數(shù)據(jù)質(zhì)量合格，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息，具有說服力。

表1 大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物測序序列數(shù)據(jù)分析Table 1 Analysis of sequences from skin mucus and intestine content in Hexagrammos otakii

2.1.2OTU分布韋恩圖(Venn) 對不同樣本OTU組成的相互關(guān)系進(jìn)行分析并構(gòu)建Venn圖。從圖1中可看出，腸道內(nèi)容物樣本中OTUs數(shù)量與表皮粘液樣本之間存在差異變化，腸道內(nèi)容物樣本中OTUs數(shù)量較多，說明腸道內(nèi)容物樣本微生物多樣性和豐富度較高。腸道內(nèi)容物和表皮粘液樣本中共有OTUs數(shù)量為33個，分別占腸道內(nèi)容物OTUs數(shù)量的16.34%、18.03%、12.04%，而占表皮粘液樣本中OTUs數(shù)量的16.26%、17.28%、17.46%，這說明不同樣本之間微生物多樣性和豐富度既存在相似性又有差異性。

注：I1, I2, I3—大瀧六線魚腸道內(nèi)容物；S1, S2, S3—大瀧六線魚表皮粘液。圖1 不同樣品OTU分布Venn圖Fig.1 OTU Venn analysis of different samples

2.1.3Rank-abundance曲線分析 統(tǒng)計每個樣本中每一個OTU所含的序列數(shù)后，將OTUs按豐度由大到小的等級排序，再以O(shè)TU等級為橫坐標(biāo)，以每個OTU中所含的序列數(shù)為縱坐標(biāo)做圖。從圖2 Rank-abundance曲線在橫坐標(biāo)軸上的長度來看，大瀧六線魚腸道內(nèi)容物的曲線較寬，說明其中微生物豐富度較高；從曲線的形狀上看，曲線越陡峭，OTU間的豐度差異越大，均勻度越低，本研究中隨著OTU等級的增加，曲線均趨平坦，說明腸道內(nèi)容物和表皮粘液樣本中微生物組成的均勻度均逐漸提高。

2.2 Alpha多樣性分析

對不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha多樣性指數(shù)(Chao1，Simpson，Shannon，Goods coverage)進(jìn)行統(tǒng)計。由表2可見，不同樣本的coverage均達(dá)到了0.999以上，說明本研究樣本中序列未檢出的可能性小，結(jié)果可真實地反映微生物群落多樣性。其中腸道內(nèi)容物樣本I3和表皮粘液樣本S2中的Chao1指數(shù)較高，表明樣本微生物群落的豐富度較高；且表皮粘液樣本S2和腸道內(nèi)容物樣本I3中Shannon指數(shù)(Shannon-wiener diversity index)和Simpson指數(shù)(Simpson diversity index)較高，表明樣本微生物的物種多樣性較高。不同樣本的物種多樣性存在差異，可能與大瀧六線魚的養(yǎng)殖環(huán)境、攝食條件等因素有關(guān)。

注：I1, I2, I3—大瀧六線魚腸道內(nèi)容物；S1, S2, S3—大瀧六線魚表皮粘液。圖2 Rank-abundance曲線圖 Fig.2 Rank-abundance curve

表2 大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物中微生物多樣性統(tǒng)計Table 2 Diversity indexes of microbiome from skin mucus and intestine content in Hexagrammos otakii

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性分析采用PCoA對多維數(shù)據(jù)降維后提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，與alpha多樣性一起構(gòu)成了總體多樣性或不同組織來源微生物物種的異質(zhì)性。從圖3中可知，橫坐標(biāo)為PCo1，貢獻(xiàn)率值為53.43%、38.63%，縱坐標(biāo)為PCo1，貢獻(xiàn)率值為28.29%、16.46%；這2個主成分是樣本微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異的主要因子。本研究中，大瀧六線魚腸道內(nèi)容物和表皮粘液樣本來自完全不同的環(huán)境，結(jié)果體現(xiàn)了不同樣本中物種的異質(zhì)性和多樣性，同類樣本距離較近，其群落組成相似。

2.4 群落結(jié)構(gòu)組成分析

進(jìn)一步對不同樣本中的細(xì)菌類別和相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計。從表3～6中可得，優(yōu)勢菌門均為藍(lán)菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)；其中藍(lán)菌門豐度比例較高，可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境及水質(zhì)條件引起的。進(jìn)一步對細(xì)菌菌屬組成進(jìn)行分析，腸道內(nèi)容物樣本中優(yōu)勢菌屬包括Streptophyta、芽孢桿菌屬(Bacillus)、未分類桿菌屬(Bacillaceae_unclassified)、氣單胞菌屬(Aeromonas)，除Streptophyta外，高豐度的芽孢桿菌屬可能較多地發(fā)揮益生菌的作用，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收；表皮粘液樣本中優(yōu)勢菌屬包括Streptophyta、氣單胞菌屬(Aeromonas)、未分類桿菌屬(Bacillaceae_unclassified)、香味菌屬(Myriudes)、假單胞菌屬(Gemmobacter)及弧菌屬(Vibrio)，因其接觸到復(fù)雜的外界環(huán)境，其中可能含有更多的條件性致病菌。這說明不同組織來源微生物菌群分布情況不同，不同的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

注：I1, I2, I3—大瀧六線魚腸道內(nèi)容物；S1, S2, S3—大瀧六線魚表皮粘液。圖3 PCoA 分析中2D PCoA 圖(多樣性比例)Fig.3 2D PcoA graph in PCoA anlysis (percentage of diversity)

表3 大瀧六線魚表皮粘液中微生物門水平結(jié)構(gòu)及相對豐度比例Table 3 Frequence and radio in microbial communities from skin mucus in Hexagrammos otakii /%

表4 大瀧六線魚腸道內(nèi)容物中微生物門水平結(jié)構(gòu)及相對豐度比例Table 4 Frequence and radio in microbial communities from intestine content in Hexagrammos otakii /%

表5 大瀧六線魚表皮粘液中微生物屬水平結(jié)構(gòu)及其相對豐度比例Table 5 Frequence and radio of genus in microbial communities from skin mucus in Hexagrammos otakii /%

表6 大瀧六線魚腸道內(nèi)容物中微生物屬水平結(jié)構(gòu)及其相對豐度比例Table 6 Frequence and radio of genus in microbial communities from intestine content in Hexagrammos otakii /%

2.5 不同樣本微生物群落的差異分析

為了進(jìn)一步探究不同來源微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，本實驗從屬水平上構(gòu)建了樣品聚類關(guān)系樹的熱圖 (heatmap)。從圖4可以得出，大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物微生物種類存在差異的同時也有很大的共同之處。微生物根據(jù)進(jìn)化關(guān)系聚類為兩大分支，其中樣本I3和S1構(gòu)成一支，另外4個樣本構(gòu)成一支，說明I3和S1樣本中的微生物群落結(jié)果與其他樣本有所不同。結(jié)構(gòu)組成與功能關(guān)系相輔相成，從不同的菌群結(jié)構(gòu)中可探索發(fā)現(xiàn)特有的或缺少的生物學(xué)功能。本研究熱圖中的藍(lán)色方塊，表明這種微生物含量非常低，這些結(jié)果可為后續(xù)微生態(tài)制劑或飼料添加劑的研發(fā)提供參考。

2.6 不同樣本中潛在細(xì)菌類病原的分布

將大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物中豐度>0.1%的潛在病原菌進(jìn)行統(tǒng)計，如表5所示，有13種潛在的病原菌及其分布特征。這些病原菌主要隸屬于厚壁菌門、變形菌門，也是本研究中表皮粘液和腸道內(nèi)容物中的優(yōu)勢菌門。各致病菌的臨床意義詳見表5[28-31]，結(jié)果可以在依據(jù)菌群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行病害防控時提供數(shù)據(jù)參考。

3 討論

研究微生物群落多樣性的傳統(tǒng)方法是依賴實驗室純培養(yǎng)技術(shù)，分離純化得到單一菌株后進(jìn)行鑒定，但在復(fù)雜的共生體系中許多微生物無法人工培養(yǎng)，這種方法在獲得微生物的數(shù)量和種類上都存在很大的局限性，因此不能準(zhǔn)確反映其微生物多樣性[32]。近年來，DGGE、TGGE、16S rRNA高通量測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同來源微生物多樣性的分析中，填補(bǔ)了無法在傳統(tǒng)實驗室中培養(yǎng)的微生物的研究空白，解決了準(zhǔn)確率低、操作復(fù)雜等問題，拓展了對微生物資源的利用空間，也為研究微生物間的相互作用提供了有效工具[33-40]。本研究基于16S rRNA高通量測序技術(shù)對微生物V3+V4區(qū)進(jìn)行測序分析，獲得了大量的、全面的且深入的菌群信息，主要關(guān)注大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物中潛在致病菌的結(jié)構(gòu)特征，為后續(xù)大瀧六線魚的病害防控及藥物研發(fā)提供了依據(jù)。

注：I1, I2, I3—大瀧六線魚腸道內(nèi)容物；S1, S2, S3—大瀧六線魚表皮粘液。圖4 屬水平上大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物微生物組成熱圖Fig.4 Heatmap of genus in microbial communities from skin mucus and intestine content in Hexagrammos otakii

表7 大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物微生物中潛在病原菌分布特征及臨床意義Table 7 The characteristics and clinical significance of potentially pathogenic microorganisms in the intestine contents and skin mucus in Hexagrammos otakii

魚表皮粘液和腸道微生物都是機(jī)體的重要組成部分，在維持生長發(fā)育、生理代謝及病害防御等方面發(fā)揮著重要作用[41-42]。本研究結(jié)果統(tǒng)計，腸道內(nèi)容物中微生物豐富度較高，高豐富度的微生物是有益于宿主健康的，既能對腸道穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)，又能促進(jìn)多種營養(yǎng)物質(zhì)的消化；表皮粘液中微生物多樣性較高，可能因為魚表皮黏液層位于魚體的最外層，能夠接觸到復(fù)雜的外界環(huán)境，因此增加了微生物的多樣性。有研究報道，虹鱒腸道內(nèi)容物和粘膜層中細(xì)菌多樣性存在顯著差異，擬桿菌門和梭桿菌門只存在于腸道內(nèi)容物中，不同組織來源之間的菌群結(jié)構(gòu)不同[43]；洪斌等[44]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦腸道優(yōu)勢菌為變形菌門，而羅氏沼蝦為厚壁菌門，不同宿主之間的菌群結(jié)構(gòu)不同；劉文舒等[45]研究報道，黑斑蛙(Rananigromaculatahowell)腸道前、中、后不同部位的微生物組成結(jié)構(gòu)同樣存在顯著差異。本實驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容中菌群結(jié)構(gòu)不同，有一些細(xì)菌是容易黏附在表皮的，有一些細(xì)菌可能是定植在腸道中的。通過與RDP數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，在門水平上占絕對優(yōu)勢的菌群是藍(lán)菌門，其次是變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，這與Wu等[46]對黃鯰(Pelteobagrusfulvidraco)的研究、Yang等[47]對暗紋東方鲀(Takifuguobscures)的研究結(jié)果不同，與Clements等[48]研究發(fā)現(xiàn)的3種不同海水魚(Kyphosussydneyanus、Odaxpullus和Aplodactylusarctidens)后腸中優(yōu)勢菌是厚壁菌門和梭菌門不同，與Lyons[49]研究的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道內(nèi)優(yōu)勢菌是柔膜菌門結(jié)果也不同，這些都說明不同組織來源的微生物因其宿主特征、養(yǎng)殖環(huán)境、飼料營養(yǎng)以及水質(zhì)條件不同，其優(yōu)勢菌屬會不同，間接反映了宿主及其微生物結(jié)構(gòu)對病害抵抗能力的異質(zhì)性。本研究中，大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物中藍(lán)菌門高豐度存在，可能因為所處養(yǎng)殖環(huán)境和水質(zhì)條件造成的；其次是豐度較高的變形菌門，除了由脂多糖組成外膜結(jié)構(gòu)的運(yùn)動型種類外，還有一些黏菌、兼性或?qū)Ｐ詤捬跣图?xì)菌等，主要參與蛋白質(zhì)代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等各種生命活動；另有芽孢桿菌屬等厚壁菌門，可通過分解纖維素，提高宿主的營養(yǎng)利用率，從而維持腸道微生物的生態(tài)平衡[50-52]。和腸道內(nèi)容物比較，表皮粘液中的氣單胞菌屬含量稍高，可參與分解水環(huán)境中的碳水化合物、化能有機(jī)營養(yǎng)等物質(zhì)；嗜冷桿菌屬的存在使得魚表皮粘液內(nèi)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出“抗凍能力”，保護(hù)機(jī)體在惡劣環(huán)境內(nèi)免受傷害；香味菌屬的存在可參與水環(huán)境的優(yōu)化，可能是因為其能夠降解多環(huán)芳烴類物質(zhì)發(fā)揮的作用。但是，表皮粘液中的這些菌屬可能也增加了表皮條件性致病菌的暴發(fā)。因此，進(jìn)一步研究不同因素壓力下的大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)，有助于更加全面地分析其細(xì)菌多樣性，了解微生物和宿主協(xié)同進(jìn)化過程中的變化。

鑒于變形菌門、厚壁菌門廣泛分布于養(yǎng)殖動物中，在各種不同條件下均可能導(dǎo)致潛在的危害，故不同組織來源的潛在致病菌也是我們研究的焦點。然而，魚類腸道、表皮都是細(xì)菌性疾病最可能的侵入點。魚類表皮黏液層是非特異性免疫的重要組成部分，由于其位于最外層而成為抗感染的第一個屏障，了解表皮粘液微生物結(jié)構(gòu)將有助于發(fā)現(xiàn)病害防控措施，對于健康養(yǎng)殖有著重要意義。例如氣單胞菌可引起魚體表面潰爛、鰭基部充血發(fā)紅或肛門紅腫等[53]，愛德華氏菌可引起魚體鰓絲糜爛、表皮潰爛，甚至伴隨腸炎發(fā)生等[54]。本研究中表皮粘液含有的氣單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、弧菌屬和香味菌屬含量稍高，在環(huán)境脅迫、機(jī)體免疫力低下時，可能引發(fā)上述病征或其他基礎(chǔ)性疾病，最終導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益和社會效益的損失。腸道內(nèi)容物中芽孢桿菌屬等包含益生菌的同時也伴有條件性致病菌的存在，如低含量的氣單胞菌屬、弧菌屬等；這些結(jié)果均為大瀧六線魚細(xì)菌性疾病的防控提供了參考，在養(yǎng)殖過程中了解其動態(tài)變化并對這些條件致病菌準(zhǔn)確認(rèn)知，對預(yù)防魚類養(yǎng)殖疾病具有現(xiàn)實意義。如王純等[55]研究報道，患病大西洋鮭魚中弧菌科和氣單胞菌科細(xì)菌豐度顯著高于健康魚，這樣的研究更有助于我們在解析魚體腸道微生物多樣性的同時，深入探究相關(guān)菌群所能發(fā)揮的功能，預(yù)警養(yǎng)殖過程中的相關(guān)疾病及防控方法，開發(fā)新型的功能性飼料添加劑等。值得注意的是，條件致病菌不是時刻都會導(dǎo)致病害的發(fā)生，只有在宿主遭受免疫或生理壓力等特定的惡劣環(huán)境下才會暴發(fā)，正常情況下條件致病菌的存在也是必需的、無害的[56]，其機(jī)理尚待研究。

本研究團(tuán)隊推測，大瀧六線魚表皮粘液和腸道內(nèi)容物微生物功能相似又不同。表皮粘液中微生物可通過誘導(dǎo)宿主固有免疫或營養(yǎng)交換等不同方式阻止病原菌的入侵或定植，做好第一道防線。腸道內(nèi)容物中一些高產(chǎn)酶能力的微生物參與宿主營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，一些形成生物膜的厭氧菌參與機(jī)體的天然物理屏障，一些高營養(yǎng)代謝產(chǎn)物參與抑菌、殺菌共同抵御病原菌的入侵，協(xié)助機(jī)體完善營養(yǎng)代謝功能及防御功能，更詳細(xì)的功能探究需要更多的研究數(shù)據(jù)來佐證。因此，利用宏基因組等多組學(xué)聯(lián)合技術(shù)開展微生物研究是發(fā)展的主要方向，探究具有重要功能的微生物，良好的病害防控及預(yù)警將成為保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)長遠(yuǎn)發(fā)展的關(guān)鍵。