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    異養(yǎng)同化降解氯代烴的研究現(xiàn)狀、微生物代謝特性及展望

    2020-07-31 08:48:32張浩邢志林汪軍趙天濤
    生物工程學(xué)報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:氯代異養(yǎng)烯烴

    張浩,邢志林,汪軍,趙天濤

    1 重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400050

    2 重慶市環(huán)境科學(xué)研究院,重慶 401147

    氯代烴 (Chlorinated hydrocarbons,CAHs),包括氯代烷烴、氯代烯烴和氯代芳烴,其作為重要化工原材料和有機(jī)溶劑在工業(yè)生產(chǎn)和生活中被廣泛使用[1]。由于CAHs存儲(chǔ)和處置不當(dāng),造成了世界范圍內(nèi)工業(yè)園區(qū)、冶金礦業(yè)、醫(yī)藥企業(yè)等場(chǎng)地及地下水的嚴(yán)重污染[2-3]。美國(guó)環(huán)保局對(duì)39個(gè)小城鎮(zhèn)地下水水源進(jìn)行檢測(cè),在已處理和未經(jīng)處理的地下水中都發(fā)現(xiàn)了11種CAHs[4],德國(guó)Bitterfeld地區(qū)經(jīng)過近百年的化學(xué)工業(yè)發(fā)展,土壤和地下水受到了CAHs的嚴(yán)重污染,涉及的土壤面積高達(dá)25 km2,約有2億m3的地下水遭受污染[5]。我國(guó)“水中優(yōu)先控制污染物”中前 9種均為 CAHs,且CAHs具有潛在的“三致” (致癌、致畸、致突變)效應(yīng)和遺傳毒性效應(yīng),對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成重大威脅[1]。盡管 CAHs的污染控制已經(jīng)持續(xù)研究了60多年,但當(dāng)前治理現(xiàn)狀依然不容樂觀。因此,采取有效措施減少環(huán)境中的CAHs污染迫在眉睫。

    生物法作為一種降解高效、環(huán)境友好和成本較低的修復(fù)方式,在CAHs的去除中一直備受關(guān)注[6]。厭氧還原脫氯、好氧共代謝和異養(yǎng)同化是CAHs生物降解的主要途徑[7]。在嚴(yán)格厭氧條件下,CAHs作為電子受體,還原性物質(zhì)作為電子供體,通過水解作用或親核反應(yīng)脫去氯原子的過程即為厭氧還原脫氯[8]??蒲泄ぷ髡哚槍?duì)厭氧脫氯開展了廣泛系統(tǒng)的研究[9-11],包括厭氧脫氯相關(guān)微生物、脫氯機(jī)理、降解酶及影響因子等。厭氧脫氯主要發(fā)生在三氯乙烯 (Trichloroethylene,TCE)、四氯乙烯 (Perchloroethylene,PCE)、三氯苯 (Trichlorobenzenes,TCBs) 和六氯苯(Hexachlorobenzene,HCB) 等高氯取代烴中,這些CAHs在還原脫鹵酶的作用下轉(zhuǎn)化為低氯取代物[12]。典型厭氧脫氯微生物有脫鹵桿菌屬Dehalobacter、脫鹵擬球菌屬Dehalococcoides、脫硫桿菌屬Desulfifitobacterium、地桿菌屬Geobacter[13],但只有Dehalococcoides可實(shí)現(xiàn)氯原子的全部脫除。好氧共代謝是CAHs生物降解的另一途徑,微生物通過代謝生長(zhǎng)基質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生單加氧酶或雙加氧酶實(shí)現(xiàn)CAHs的降解[14],CAHs不作為碳源和能源也不能被微生物轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)[15]。好氧共代謝研究持續(xù)多年,涉及共代謝降解微生物的篩選、生長(zhǎng)基質(zhì)的優(yōu)化以及共代謝降解機(jī)理的解析[7,16]。最典型共代謝微生物為甲烷氧化菌Methanotrophs[17]。這些研究為 CAHs污染的修復(fù)提供了重要的理論基礎(chǔ),基于這些理論,研究者正開展CAHs的場(chǎng)地修復(fù)工作[7]。

    異養(yǎng)同化作用是CAHs降解的第3種途徑,與厭氧脫氯和共代謝降解相比,異養(yǎng)同化過程避免額外添加有機(jī)物,同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生二次污染,在CAHs污染降解中具有重大應(yīng)用潛力[18]。當(dāng)前,已報(bào)道可通過微生物異養(yǎng)同化作用降解的 CAHs種類十分有限,利用異養(yǎng)同化作用實(shí)現(xiàn)場(chǎng)地修復(fù)的研究還未有報(bào)道。開展 CAHs異養(yǎng)同化過程的系統(tǒng)性認(rèn)識(shí),明晰 CAHs異養(yǎng)同化規(guī)律,對(duì)于如何強(qiáng)化、應(yīng)用異養(yǎng)同化過程,擴(kuò)大CAHs的修復(fù)途徑將具有重要的推動(dòng)作用。國(guó)內(nèi)外許多研究對(duì)厭氧脫氯和好氧共代謝過程已進(jìn)行系統(tǒng)性總結(jié)[9-11,15-16],對(duì)于如何優(yōu)化調(diào)控厭氧脫氯和好氧共代謝過程有了一定的依據(jù)。而關(guān)于CAHs異養(yǎng)同化過程的總結(jié)還未見報(bào)道。基于此,本文將對(duì)異養(yǎng)同化降解的研究現(xiàn)狀進(jìn)行系統(tǒng)性總結(jié),包括可發(fā)生異養(yǎng)同化CAHs的類型、降解特性,典型氯代烴異養(yǎng)同化的降解機(jī)理、相關(guān)微生物及其降解酶,并基于異養(yǎng)同化降解CAHs存在的問題提出未來重點(diǎn)關(guān)注的發(fā)展方向,將為CAHs異養(yǎng)同化的深入研究和場(chǎng)地修復(fù)實(shí)踐提供重要的理論依據(jù)。

    1 CAHs異養(yǎng)同化過程及優(yōu)勢(shì)

    CAHs三種代謝途徑的特點(diǎn)如表 1所示。厭氧還原脫氯過程CAHs作為電子受體,還原性物質(zhì)作為電子供體,通過水解作用或親核反應(yīng)脫去氯原子。所有氯代烴均可發(fā)生還原脫氯,但隨著分子中氯原子數(shù)量的減少,還原脫氯的速率會(huì)迅速降低[19]。另外,厭氧脫氯發(fā)生環(huán)境要求苛刻,菌群數(shù)量和活性往往較低,且還需要不斷添加電子供體。因此,該過程極易造成低氯取代物和其他副產(chǎn)物的大量積累[20-21]。好氧共代謝降解過程中CAHs被細(xì)胞代謝生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的單加氧酶或雙加氧酶降解,CAHs不為微生物提供能源和碳源,該過程需要添加大量生長(zhǎng)基質(zhì),極易造成環(huán)境的二次污染;共代謝降解產(chǎn)生的環(huán)氧化合物和氯代醛類化合物也會(huì)造成微生物的活性降低;同時(shí)降解過程中生長(zhǎng)基質(zhì)和CAHs污染物會(huì)與關(guān)鍵酶競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn),產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制[22]。盡管已有厭氧脫氯和好氧共代謝過程用于場(chǎng)地修復(fù)的案例[23],但由于上述問題的限制,往往造成處理成本過高、修復(fù)效果差和修復(fù)時(shí)間長(zhǎng)等問題。因此,面對(duì)日益嚴(yán)格環(huán)保需求,擴(kuò)大CAHs的生物修復(fù)途徑已十分必要。

    CAHs異養(yǎng)同化作為另一種途徑為場(chǎng)地修復(fù)提供了新的選擇,異養(yǎng)同化過程中微生物以CAHs為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng),將其礦化為 H2O、CO2和Cl–等小分子化合物并合成自身生物質(zhì)[24]。CAHs在微生物細(xì)胞內(nèi)的異養(yǎng)同化過程如圖 1所示。CAHs通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi),在酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化,為微生物生長(zhǎng)提供必需的碳源和能源,同時(shí)中間產(chǎn)物通過絲氨酸途徑轉(zhuǎn)化為生物質(zhì),代謝生成的氯離子最終排出細(xì)胞外。與好氧共代謝和厭氧脫氯相比,異養(yǎng)同化優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在以下方面:(1) 避免有毒中間產(chǎn)物的生成,特別是對(duì)降解酶和微生物有毒害作用的環(huán)氧化合物,同時(shí)異養(yǎng)同化避免產(chǎn)生低氯取代烴[21]。(2) 無需添加額外生長(zhǎng)基質(zhì),無二次污染,同時(shí)避免了在代謝過程中生長(zhǎng)底物與 CAHs競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)[22]以及生長(zhǎng)底物對(duì)氧的消耗[21-22,25]。如何利用 CAHs異養(yǎng)同化過程也將是未來場(chǎng)地修復(fù)研究的熱點(diǎn)。

    表1 CAHs三種代謝途徑的特點(diǎn)[26]Table 1 Characteristics of three metabolic pathways of CAHs[26]

    圖1 微生物細(xì)胞中典型氯代烴異養(yǎng)同化過程[27]Fig. 1 Assimilation of CAHs in microbial cell[27].

    2 CAHs異養(yǎng)同化降解研究概述

    2.1 可發(fā)生異養(yǎng)同化降解的CAHs種類

    目前,研究報(bào)道可通過異養(yǎng)同化途徑降解的CAHs有一氯甲烷 (Chloromethane,CM)[28]、二氯甲烷 (Dichloromethane,DCM)[29-30]、三氯甲烷(Chloroform,CF)、四氯化碳 (Carbon tetrachloride,CT)[31]等氯代烷烴;氯乙烯 (Vinyl chloride,VC)[32-33]、順式二氯乙烯 (cis-1,2-dichloroethene,c-1,2-DCE)[21,34]、反式二氯乙烯 (trans-1,2-dichloroethylene,t-1,2-DCE)[18]、TCE 等氯代烯烴;氯苯 (Chlorobenzene,CB)[35-36]、1,2-二氯苯(1,2-dichlorobenzene,1,2-DCB)[37]、1,4-二氯苯(1,4-dichlorobenzene,1,4-DCB)[38]、1,2,3-三氯苯(1,2,3-trichlorobenzene,1,2,3-TCB)、1,3,5-三氯苯(1,3,5-trichlorobenzene,1,3,5-TCB)[39]等氯代芳烴。典型CAHs的Cl/C比結(jié)果如圖2所示。隨氯取代程度的增大,氯代烷烴異養(yǎng)同化降解性急劇下降,除 CT外,其他全氯代烴無法通過異養(yǎng)同化途徑降解。所有氯代甲烷都可作為微生物碳源和能源被降解[28-29,31],表明氯代烷烴可以廣泛地被微生物同化。除四氯乙烯外,其他氯代乙烯均可發(fā)生異養(yǎng)同化降解,發(fā)生異養(yǎng)同化的氯代烯烴Cl/C的比值低于 2。氯代芳烴中,氯取代程度小于3的氯代芳烴可通過異養(yǎng)同化降解是廣泛報(bào)道的。CAHs中氯取代程度越高,化合物電負(fù)性越強(qiáng),在有氧條件下難以發(fā)生異養(yǎng)同化[40]。綜上所述,能通過異養(yǎng)同化途徑進(jìn)行降解的CAHs以代氯取代烴 (1–3個(gè)氯原子) 為主,準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)場(chǎng)地CAHs污染特性也是開展場(chǎng)地修復(fù)的重要前提。

    圖2 典型氯代烴Cl/C比Fig. 2 Cl/C ratio of typical CAHs.

    2.2 CAHs異養(yǎng)同化的微生物及降解特性

    已報(bào)道CAHs異養(yǎng)同化微生物主要來自污染場(chǎng)地土壤、地下水、化工廢水處理廠的活性污泥以及人工馴化的專性降解菌[31,38],這些微生物包括純菌株和混合菌,混合菌相對(duì)于純菌對(duì)污染物具有更好的降解效率,且對(duì)環(huán)境具備更好的適應(yīng)性[20]。已分離的典型CAHs異養(yǎng)同化降解菌屬主要有生絲微菌屬Hyphomicrobium、假單胞菌屬Pseudomonas、分支桿菌屬M(fèi)ycobacterium、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、類諾卡氏菌屬Nocardioides、芽孢桿菌屬Bacillus、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas等,大多數(shù)的降解菌只對(duì)特定的CAHs產(chǎn)生作用,但也有少部分降解菌如銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosastrain S1-2[18]、腸桿菌Enterobactersp.SA-2、Pseudomonassp.SA-6[39]、紅球菌Rhodococcus phenolicusG2PT[41]等可降解兩種及以上的 CAHs。對(duì)已分離篩選具有 CAHs異養(yǎng)同化作用的微生物進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié),結(jié)果如表2所示。

    2.2.1 氯代烷烴異養(yǎng)同化微生物

    已報(bào)道分離的氯代烷烴異養(yǎng)同化降解菌屬主要包括Hyphomicrobium、Pseudomonas、Nocardioides、氨基桿菌屬Aminobacter、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、副球菌屬Paracoccus、Bacillus等。氯代烷烴類污染物分布廣泛,多種氯代烷烴均可作為微生物底物,研究人員從多種環(huán)境分離了這些菌株。McAnulla等[42]從陸地、河口、海洋中分離出 6株屬于Hyphomicrobiumsp.、Aminobactersp.和Nocardioidessp.的 CM降解菌。Jeffra等[28]從海水中分離的菌株Leisingera methylohalidivoransMB2T不僅能以CM為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)還能同化溴甲烷和碘甲烷。Doronina等[43]從污染地下水中分離出一種新型的革蘭氏陰性菌株P(guān)aracoccus methylutenssp.nov. DM12,該菌株可以 DCM為唯一碳源。而 Wu等[30]從制藥污水中分離出的 DCM 降解微生物芽孢桿菌Lysinibacillus sphaericuswh22,還能以 1,2-二氯乙烷 (1,2-dichloroethane,1,2-DCA)、氯溴甲烷(Chlorobromomethane,CBM)、1,1,1-三氯乙烷(1,1,1-trichloroethane,1,1,1-TCA) 和 TCE為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。CF和CT等高氯代烷烴,難以作為微生物生長(zhǎng)的唯一碳源,Olaniran等[31]分離出兩株能以底物濃度為0.1% (W/V) 的CF和CT為唯一碳源和能源的降解菌Bacillus(GBB416) 和Pseudomonas(GBB417),這是唯一一篇報(bào)道的對(duì)CT具有異養(yǎng)同化降解功能的菌株,實(shí)現(xiàn)了高氯代烷烴異養(yǎng)同化降解研究的突破。氯代烷烴類污染物分布廣泛,多種氯代烷烴均可作為微生物底物,在氯代烷烴污染場(chǎng)地,異養(yǎng)同化降解是十分有效的修復(fù)途徑。

    表2 異養(yǎng)同化微生物的生長(zhǎng)及代謝特征Table 2 Growth and metabolic characteristics of CAH-assimilating microorganisms

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    2.2.2 氯代烯烴異養(yǎng)同化微生物

    氯代烯烴在環(huán)境中的檢出率較高,毒性更大,研究人員在污染場(chǎng)地中分離出許多氯代烯烴異養(yǎng)同化降解菌,主要包括Pseudomonas、Mycobacterium、Nocardioides、Stenotrophomonas和蒼白桿菌屬Ochrobactrum等。大多數(shù)氯代烯烴異養(yǎng)同化微生物是以特定的基質(zhì)為生長(zhǎng)底物、通過長(zhǎng)期馴化衍生的特異性菌株。Verce等[44]報(bào)道了第一株以 VC為唯一碳源的Pseudomonas aeruginosaMF1,該菌株以VC為唯一基質(zhì)長(zhǎng)期馴化篩選獲得,菌株MF1不僅具有長(zhǎng)時(shí)間的耐饑餓能力,還具有很強(qiáng)的VC耐受能力,當(dāng)VC濃度增加到7.3 mmol/L時(shí)對(duì)生長(zhǎng)也無抑制作用。除純菌外,Singh等[20]通過長(zhǎng)期馴化從污染場(chǎng)地中篩選出一組由Mycobacteria和Rhodococcus構(gòu)成的混合菌,當(dāng)VC濃度為50–250 μmol/L時(shí)可被混合菌迅速降解。相同功能的不同菌株降解能力差異明顯,Elango發(fā)現(xiàn)從高濃度VC環(huán)境分離出的羅爾斯通菌Ralstoniasp.TRW-1對(duì)VC的降解能力是其他分枝桿菌的3–10倍[45]。

    除VC外,c-1,2-DCE也能作為微生物生長(zhǎng)的唯一碳源。Schmidt等研究了污染地下水中c-1,2-DCE的異養(yǎng)同化過程,在多種條件下觀察到了c-1,2-DCE生物降解過程的穩(wěn)定性同位素分餾,通過蛋白質(zhì)的形成證明了 c-1,2-DCE可作為微生物生長(zhǎng)的唯一碳源和能源[21]。隨后,Olaniran等利用富集培養(yǎng)技術(shù)從尼日利亞和南非的污染場(chǎng)地分離出5株c-1,2-DCE的異養(yǎng)同化降解菌,分別屬于棒狀桿菌屬Corynebacteriumsp.、Bacillussp.、伯克氏菌屬Burkholderiasp.、微球菌屬M(fèi)icrococcussp.和Pseudomonassp.,這些菌均可以 c-1,2-DCE為唯一碳源和能源,降解率為59%–86%[46]。此外,Bradley等[47]從黑臭水體中分離出一組 c-1,2-DCE降解混合菌,在濃度為50 μmol/L的條件下可以實(shí)現(xiàn)c-1,2-DCE的完全降解并檢測(cè)出大量 CO2的生成,表明該混合菌具有高效的c-1,2-DCE同化能力。盡管VC和DCE容易作為微生物碳源被異養(yǎng)同化降解,但隨著氯取代程度的增大,異養(yǎng)同化降解難度急劇增大。迄今為止,只發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophiliaPM102[48]和Bacillussp.2479[49]具有TCE的異養(yǎng)同化降解能力,還未有直接證據(jù)證明PCE可通過異養(yǎng)同化途徑實(shí)現(xiàn)降解。因此,在多氯取代烯烴的污染場(chǎng)地,采用異養(yǎng)同化與厭氧還原脫氯結(jié)合的修復(fù)措施可實(shí)現(xiàn)污染物的有效去除。

    2.2.3 氯代芳烴異養(yǎng)同化微生物

    氯代芳烴作為持久性有機(jī)污染物,其異養(yǎng)同化微生物的篩選分離研究已開展多年,研究主要集中在氯取代數(shù)小于3的氯苯類有機(jī)物。研究人員以CB為唯一碳源,分離篩選的不動(dòng)桿菌Acinetobactersp.CB001[35]和代爾夫特菌Delftia tsuruhatensisLW26[36]除了能以CB為唯一碳源外,也能以二氯苯 (Dichlorobenzenes,DCBs) 為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。另外,Haigler等[50]從活性污泥中分離出一株以 1,2-DCB為唯一碳源和能源生長(zhǎng)的菌株P(guān)seudomonassp.JS100,該菌株也能以CB為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)。此外,Monferrán等[37]以1,2-DCB 為唯一碳源篩選的燕麥?zhǔn)乘峋鶤cidovorax avenae降解污染物范圍更廣,能夠以CB、1,3-DCB和 1,4-DCB為碳源和能源生長(zhǎng)。TCBs異養(yǎng)同化降解菌也存在類似的情況,Adebusoye等[39]分離的菌株Enterobactersp.SA-2和Pseudomonassp.SA-6不僅可以異養(yǎng)同化1,2,3-TCB和1,3,5-TCB,也能以1,4-DCB為唯一碳源和能源生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明,氯代芳烴異養(yǎng)同化微生物之間可能存在較高的同源性。

    2.2.4 異養(yǎng)同化微生物的生長(zhǎng)代謝特性

    氯代烷烴異養(yǎng)同化微生物生長(zhǎng) pH值范圍為 6.5–7.7,溫度為 25–30 ℃。當(dāng) CAHs濃度為0.1–10 mmol/L時(shí),最大比生長(zhǎng)速率范圍為0.05–6.63 h–1,氯代烷烴的平均降解率均在92%以上。在異養(yǎng)同化過程中,生長(zhǎng)基質(zhì)濃度對(duì)微生物生長(zhǎng)和代謝速率有較大的影響。CAHs濃度過高,產(chǎn)生毒性抑制,微生物生長(zhǎng)緩慢;CAHs濃度過低,微生物底物匱乏,限制微生物生長(zhǎng)。菌株Hyphomicrobiumsp.MC1在氣相濃度為1%的MC中最大比生長(zhǎng)速率為 0.09 h–1,當(dāng)氣相濃度增到10%時(shí)最大比生長(zhǎng)速率降為0.04 h–1[51]。此外,不同微生物對(duì)CAHs利用效率也具有很大差別,當(dāng)DCM濃度相同時(shí),菌株HyphomicrobiumDM2和Pseudomonassp. DM1的最大比生長(zhǎng)速率分別為0.07 h–1和 0.11 h–1[52]。為進(jìn)一步解析代謝機(jī)理,Wu等[30]從 DCM 異養(yǎng)同化菌株Lysinibacillus sphaericuswh22提取質(zhì)粒pRC11,并轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中,該重組大腸桿菌菌株能在 5–16 mmol/L DCM的條件下正常生長(zhǎng),表明該基因可能是DCM代謝的關(guān)鍵基因。

    氯代烯烴作為微生物生長(zhǎng)的唯一碳源被廣泛報(bào)道[44],這些氯代烯烴同化微生物的最適生長(zhǎng)溫度為 20–37 ℃,pH為 6.5–7.5。當(dāng)氯代烯烴濃度為0.15–10.00 mmol/L時(shí),微生物最大比生長(zhǎng)速率范圍為 0.002–15.720 h–1,降解率在 60%–100%。菌株P(guān)seudomonas aeruginosaMF1以VC為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí),6 mmol/L的VC在35 d內(nèi)可完全降解[44]。氯代烯烴異構(gòu)體同樣影響微生物代謝特性,Olaniran從非洲污染場(chǎng)地中分離出7株DCE異養(yǎng)同化微生物,在 1 mmol/L的 c-1,2-DCE和1.5 mmol/L的t-1,2-DCE為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí),比生長(zhǎng)速率分別為 0.014–0.023 h–1和 0.019–0.028 h–1,平均降解率為 70%–75%和 60%–72%,其中t-1,2-DCE培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度要高于c-1,2-DCE,可能是因?yàn)閏-1,2-DCE氧化生成環(huán)氧化合物具有更高的毒性[18]。與純菌相比,混合菌降解能力更高,Sing分離的混合菌可迅速降解濃度為 50–250 μmol/L的 VC[20]。研究表明含氧量和pH可影響氯代烯烴的異養(yǎng)同化過程,VC降解菌株P(guān)seudomonas aeruginosaMF1在缺氧條件下培養(yǎng)2.5 d,并不能完全恢復(fù)在VC上的生長(zhǎng)能力,且降解過程中有VC環(huán)氧化合物的生成[44]。同樣的,VC降解混合菌在缺氧條件下也有VC環(huán)氧化合物生成[20],表明缺氧狀態(tài)使得VC的降解機(jī)理可能發(fā)生了改變。TCE異養(yǎng)同化降解菌Stenotrophomonas maltophiliaPM102在 pH為中性時(shí)降解率可達(dá)到90%,而pH降為5時(shí)降解率下降到77%[48]。

    氯代芳烴異養(yǎng)同化微生物最適 pH值為7.0–7.8,最適溫度為25–30 ℃,當(dāng)氯代芳烴濃度為0.002–1.000 mmol/L時(shí),微生物最大比生長(zhǎng)速率為 0.002–0.420 h–1,降解效率范圍 77%–99%,表明氯代芳烴異養(yǎng)同化微生物的活性差異較大。李明堂等[35]分離的菌株Acinetobactersp. CB001,在0.44 mmol/L的 CB條件下,120 h降解率可達(dá)98.2%。該菌株還可同化DCBs,異養(yǎng)同化能力順序?yàn)?1,3-DCB>1,2-DCB>1,4-DCB。Monferrán 等[37]以 1,2-DCB唯一碳源篩選的菌株Acidovorax avenae在2 d內(nèi)可將0.136 mmol/L的1,2-DCB完全降解,釋放全部氯原子。同樣地,菌株Enterobactersp.SA-2和Pseudomonassp.SA-6以1,2,3-TCB(0.44 mmol/L) 和1,3,5-TCB (0.43 mmol/L) 為唯一碳源和能源生長(zhǎng)時(shí),約80%–90%的 TCBs可以在200 h內(nèi)降解,且細(xì)胞濃度增加3個(gè)數(shù)量級(jí)[39]。與氯代烷烴和氯代烯烴相比,氯代芳烴降異養(yǎng)同化微生物特異性較低,對(duì)多種氯代芳烴均具有降解能力,在復(fù)合污染環(huán)境中適用性更強(qiáng)?;诋?dāng)前對(duì)CAHs異養(yǎng)同化降解菌篩選分離和生長(zhǎng)特性的研究,絕大多數(shù)降解菌具有較強(qiáng)的耐受性和降解能力,能較好地適用于氯代烴類污染物場(chǎng)地的修復(fù)工作。

    3 典型氯代烴的異養(yǎng)同化降解酶及機(jī)理

    3.1 氯代烷烴的異養(yǎng)同化

    圖3 CM和DCM同化途徑[64]Fig. 3 Assimilation pathways of chloromethane and dichloromethane[64].

    MC和 DCM 是異養(yǎng)同化降解研究最多的氯代烷烴,現(xiàn)已充分揭示了兩種氯代烷烴的代謝機(jī)理?;谖墨I(xiàn)報(bào)道總結(jié)的MC和DCM的降解機(jī)理如圖3所示。MC和DCM具有相似的代謝途徑,MC首先發(fā)生脫氯反應(yīng),生成的甲基在CmuA和CmuB甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)移到四氫葉酸(Tetrahydrofolate,H4folate) 上形成甲基-H4folate,四氫葉酸連接的中間體在亞甲基-H4folate還原酶、亞甲基-H4folate脫氫酶、甲基-H4folate環(huán)水解酶、甲酰-H4folate水解酶的相繼作用下進(jìn)一步氧化生成甲酸,甲酸在甲酸脫氫酶的作用下生成CO2。此外,中間體亞甲基-H4folate可以通過絲氨酸途徑被微生物同化為自身的組成物質(zhì)。與MC不同,DCM首先在還原型谷胱甘肽 (Glutathione,GSH) 的作用下失去一個(gè)氯原子并與GSH結(jié)合生成中間產(chǎn)物S-氯甲基谷胱甘肽,中間會(huì)自發(fā)生成S-羥甲基谷胱甘肽并最終生成甲醛 (HCHO) 和谷胱甘肽 (圖 4)。形成的 HCHO 分別依賴于H4folate和四氫甲蝶呤 (Tetrahydromethanopterin,H4MPT) 途徑進(jìn)行代謝,H4MPT降解途徑普遍存在于大多數(shù)甲基營(yíng)養(yǎng)菌中[61]。HCHO 在甲醛活化酶的作用下與四氫甲蝶呤縮合成亞甲基-H4MPT,而亞甲基-H4MPT是絲氨酸循環(huán)和大多數(shù)微生物同化必需的[62-63]。亞甲基-H4MPT通過亞甲基-H4MPT脫氫酶、甲基-H4MPT環(huán)水解酶、甲酰甲基呋喃轉(zhuǎn)移酶和甲酸脫氫酶的相繼作用最終生成CO2。

    圖4 DCM的中間代謝途徑[64]Fig. 4 Intermediate metabolic pathway of dichloromethane[64].

    3.2 氯代烯烴的異養(yǎng)同化

    氯代烯烴異養(yǎng)同化降解中,只有 VC異養(yǎng)同化代謝機(jī)理被系統(tǒng)解析,降解途徑如圖5所示。VC首先在烯烴單加氧酶 (Alkene monooxygenase,AkMO) 作用下轉(zhuǎn)化為環(huán)氧氯乙烯[22],由輔酶 M轉(zhuǎn)移酶 (Coenzyme M transferase,EaCoMT) 介導(dǎo)的輔酶M (Coenzyme M,CoM) 進(jìn)一步與環(huán)氧乙烯結(jié)合形成2-氯-羥乙基-CoM,2-氯-羥乙基-CoM自發(fā)地消除氯原子生成2-酮乙基-CoM,隨后,在CoM-還原酶/羧化酶作用下生成丙二酸半醛和還原性的CoM。丙二酸半醛通過雙官能醛/醇脫氫酶的氧化生成丙二酸,在脫羧酶、輔酶A (Coenzyme A,CoA) 合成酶和 CoA轉(zhuǎn)移酶的循環(huán)中轉(zhuǎn)化為丙二酰-CoA,最終進(jìn)入三羧酸循環(huán) (Tricarboxylic acid cycle,TCA)[22]。研究者針對(duì)氯代烯烴降解酶展開了深入研究,AkMO和EaCoMT是VC異養(yǎng)同化微生物的重要酶系[33],Mycobacteriumsp.strain E20降解乙烯的研究中首次發(fā)現(xiàn)AkMO[22],研究還發(fā)現(xiàn)其他酶也參與 VC的異養(yǎng)同化過程,Danko等[57]研究證明Ochrobactrumsp.TD菌株中的脫羧酶參與 VC的降解過程,對(duì)同化過程酶生成的編碼基因進(jìn)行了深入分析,發(fā)現(xiàn)2–3個(gè)ORFs編碼參與MycobacteriumJS60和NocardioidesJS614菌株的CoA合成酶和CoA轉(zhuǎn)移酶的合成。Chuang等[65]通過蛋白質(zhì)組學(xué)和 RT-PCR確認(rèn)了VC代謝基因etnA、etnC、etnE和comA與雙功能醇/醛脫氫酶、FAD/NAD(P)H依賴性還原酶/羧化酶和CoA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)過程受到了VC的誘導(dǎo)。這些為 VC異養(yǎng)同化過程的有效調(diào)控提供了重要的理論依據(jù)。

    3.3 氯代芳烴的異養(yǎng)同化

    CB、DCBs和TCBs等典型氯代芳烴的異養(yǎng)同化過程具有相似的代謝途徑,同化過程普遍遵循“先開環(huán)再脫氯”的降解機(jī)制[36],降解過程如圖6所示。氯代芳烴在雙加氧酶的作用下發(fā)生鄰位或間位裂環(huán)脫氯,CB被依次氧化生成鄰氯苯酚、3-氯鄰苯二酚,然后在鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶的作用下,中間先后經(jīng)歷鄰位開環(huán)、脫氯、氧化等過程,最終將其礦化為CO2和轉(zhuǎn)化為生物質(zhì);1,2-DCB和1,4-DCB分別在1,2-二氯苯雙加氧酶和1,4-二氯苯雙加氧酶等酶的作用下,先后經(jīng)歷開環(huán)、脫氯、氧化后生成脫氯產(chǎn)物 5-氯馬來酸和 2-氯馬來酸[50]。研究表明,參與氯代芳烴異養(yǎng)同化過程的鄰苯二酚雙加氧酶種類很多,葉杰旭等[36]在Delftia tsuruhatensis同化CB過程中發(fā)現(xiàn)3-氯鄰苯二酚在鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶的作用下鄰位開環(huán)生成 2-氯-粘康酸。在有氧條件下黃色桿菌Xanthobacter flavus14p1對(duì)1,4-DCB的降解過程中,鄰苯二酚 1,2-雙加氧酶將 3,6-二氯鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為2,5-二氯-粘康酸[60]。菌株Enterobactersp.SA-2和Pseudomonassp.SA-6在降解1,3,5-TCB的過程中,降解 3,6-二氯鄰苯二酚的關(guān)鍵酶為鄰苯二酚2,3-雙加氧酶,且菌株SA-2比菌株 SA-6酶活性略高[39]。綜上表明,鄰苯二酚雙加氧酶是氯代芳烴異養(yǎng)同化過程中的關(guān)鍵酶。

    圖5 VC異養(yǎng)同化代謝途徑[22]Fig. 5 VC assimilation pathway[22].

    圖6 典型氯代芳烴異養(yǎng)同化生物降解途徑 (A:CB[36];B:1,2-DCB[50];C:1,4-DCB[60])Fig. 6 Assimilation pathway for typical chlorinated aromatic hydrocarbon. (A) Chlorobenzene[36]. (B)1,2-dichlorobenzene[50]. (C) 1,4-dichlorobenzene[60].

    3.4 典型氯代烴異養(yǎng)同化降解關(guān)鍵基因

    不同 CAHs異養(yǎng)同化過程功能基因差異很大,不同CAHs具有不同的特征基因,對(duì)特征基因的檢測(cè)分析可明晰微生物或環(huán)境樣品的異養(yǎng)同化降解功能。典型的CAHs異養(yǎng)同化過程特征基因的引物如表3所示。氯甲烷同化過程的特征基因?yàn)閏muA和cmuB[66],其中cmuA作為分子探針而廣泛應(yīng)用。Miller等[67]設(shè)計(jì)了cmuA的引物cmuA802和cmuA1609r用于檢測(cè)鹵甲烷降解物。隨后,Nadalig開發(fā)了兩個(gè)新的反向引物cmuA1802r和MF2,建立了cmuA的qPCR方法并用于研究綠藻球中的氯甲烷降解物[68]。DCM 異養(yǎng)同化特征基因?yàn)閐cmA,dcmA基因具有高度保守性,開發(fā)的引物CFOR/CREV[69]和DMfor/DMrev[70]可準(zhǔn)確定量環(huán)境中DCM異養(yǎng)同化微生物[71]。VC異養(yǎng)同化的特征基因?yàn)閑tnC和etnE,當(dāng)前開發(fā)的引物可以準(zhǔn)確定量功能微生物和地下水環(huán)境中特征基因含量[71-72]。氯代芳烴異養(yǎng)同化的特征基因?yàn)閍dhA1,Monferrán等[37]利用引物 17F 和 1406R 證實(shí)了菌株Acidovorax avenae對(duì)1,2-DCB的代謝途徑。CAHs特征基因的明確,對(duì)明晰 CAHs的降解產(chǎn)物、同化途徑和實(shí)際污染場(chǎng)地功能微生物的定量工作具有重要的指導(dǎo)意義。

    表3 典型CAHs異養(yǎng)同化微生物的功能基因及其引物Table 3 Primers and functional genes of CAHs-assimilation bacteria

    4 總結(jié)與展望

    異養(yǎng)同化作為CAHs的生物降解方式之一為污染場(chǎng)地生物修復(fù)提供了可選的修復(fù)方案,與其他生物代謝過程相比具有顯著優(yōu)勢(shì)。本文對(duì)可發(fā)生異養(yǎng)同化的CAHs進(jìn)行了系統(tǒng)性的總結(jié),對(duì)典型CAHs的相關(guān)微生物、異養(yǎng)同化降解途徑及其降解酶進(jìn)行了系統(tǒng)闡述。目前,報(bào)道的CAHs異養(yǎng)同化微生物和可降解CAHs的種類較少,已分離的可進(jìn)行 CAHs異養(yǎng)同化微生物僅有十幾個(gè)屬,可作為碳源和能源被微生物利用的CAHs僅限于低氯取代烴,如VC、DCE、DCM和CM,且只有一篇文章報(bào)道了TCE的異養(yǎng)同化降解[44];總結(jié)發(fā)現(xiàn),大多數(shù)微生物生長(zhǎng)條件 (pH 6.5–7.5,25–35 ℃) 均比較溫和,對(duì)于極端條件下的微生物研究甚少;另外,CAHs的異養(yǎng)同化研究主要集中在分離的純菌或群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的混合菌中,對(duì)于實(shí)際CHAs的污染場(chǎng)地中,異養(yǎng)同化降解菌的豐度、酶的種類、異養(yǎng)同化代謝強(qiáng)度、環(huán)境因子氧氣的影響特性等的信息報(bào)道還十分有限;此外,污染場(chǎng)地中氯代烴組成復(fù)雜,有些氯代烴無法作為異養(yǎng)同化微生物的碳源和能源,共存氯代烴還會(huì)抑制其他氯代烴的同化降解[75],同化降解過程氯代烴間的相互作用影響還未得到有效解決。這些問題限制了異養(yǎng)同化降解微生物在CAHs污染處理中的應(yīng)用。因此,面對(duì)日益嚴(yán)峻的CAHs污染,未來研究中關(guān)于CAHs的異養(yǎng)同化要更加關(guān)注以下幾個(gè)方面:(1) 擴(kuò)大菌株篩選范圍,獲得具有抗逆性的多種CAHs降解能力的菌株;通過基因工程和酶工程開發(fā)工程菌,如已有利用基因工程手段獲得具有CAHs異養(yǎng)同化降解功能的大腸桿菌[30]。(2) 充分利用異養(yǎng)同化降解特點(diǎn)及快速、無二次污染的優(yōu)勢(shì),開發(fā)厭氧脫氯-異養(yǎng)同化,共代謝-異養(yǎng)同化,厭氧脫氯-共代謝-異養(yǎng)同化,物化處理 (鐵還原)-異養(yǎng)同化等聯(lián)合 CAHs處理工藝,已有研究發(fā)現(xiàn)以 VC為底物可共代謝降解DCE[20]。(3) 利用宏基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等多組學(xué)技術(shù),明晰污染場(chǎng)地異養(yǎng)同化微生物基因組信息,解析不同種屬微生物對(duì)CAHs的代謝機(jī)理[76]。(4) 逐步開展異養(yǎng)同化降解的場(chǎng)地應(yīng)用,明晰場(chǎng)地環(huán)境中異養(yǎng)同化降解的影響因素,建立有效的異養(yǎng)同化實(shí)施、監(jiān)控和模擬方案。

    附:縮略詞索引

    CAHs:氯代烴,Chlorinated hydrocarbons

    TCE:三氯乙烯,Trichloroethylene

    PCE:四氯乙烯,Perchloroethylene

    TCBs:三氯苯,Trichlorobenzenes

    HCB:六氯苯,Hexachlorobenzene

    CM:一氯甲烷,Chloromethane

    DCM: 二氯甲烷,Dichloromethane

    CF:三氯甲烷,Chloroform

    CT:四氯化碳,Carbon tetrachloride

    VC:氯乙烯,Vinyl chloride

    c-1,2-DCE:順式二氯乙烯,cis-1,2-dichloroethene

    t-1,2-DCE:反式二氯乙烯,trans-1,2-dichloroethylene

    CB:氯苯,Chlorobenzene

    1,2-DCB:1,2-二氯苯,1,2-dichlorobenzene

    1,4-DCB:1,4-二氯苯,1,4-dichlorobenzene

    1,2,3-TCB:1,2,3-三氯苯,1,2,3-trichlorobenzene

    1,3,5-TCB:1,3,5-三氯苯,1,3,5-trichlorobenzene

    1,2-DCA:1,2-二氯乙烷,1,2-dichloroethane

    CBM:氯溴甲烷,Chlorobromomethane

    1,1,1-TCA:1,1,1-三氯乙烷,1,1,1-trichloroethane

    DCBs:二氯苯,Dichlorobenzenes

    H4folate:四氫葉酸,Tetrahydrofolate

    GSH:谷胱甘肽,Glutathione

    H4MPT:四氫甲蝶呤,Tetrahydromethanopterin

    AkMO:烯烴單加氧酶,Alkene monooxygenase

    EaCoMT:輔酶M轉(zhuǎn)移酶,Coenzyme M transferase

    CoM:輔酶M,Coenzyme M

    CoA:輔酶A,Coenzyme A

    TCA:三羧酸循環(huán),1,1,2-trichloroethane

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