膀胱癌組織中miR-130a-3p、SPOCK1 表達變化及意義

王浩 ，郭豐富

1 山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）臨床醫(yī)學院，山東泰安271000；2 臨沂市人民醫(yī)院

膀胱癌（BC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，病理類型以膀胱移行細胞癌最常見。全球每年BC 新發(fā)病例數(shù)達40萬，并且其發(fā)病率及病死率有逐漸上升的趨勢［1］。目前BC 治療包括根治手術治療、放化療及免疫治療等，但由于腫瘤異質性較大，患者術后易出現(xiàn)局部復發(fā)和遠處轉移，嚴重威脅患者生命［2］。因而，有必要研究BC的發(fā)病機制，尋找新的BC的腫瘤標志物。微小RNA（miRNA）是細胞內(nèi)無蛋白編碼功能的具有短發(fā)夾結構的RNA 分子，長度為19～25個核苷酸，其參與構成RNA 誘導的沉默復合物結合靶基因mRNA 的3"非編碼區(qū)，促進靶基因mRNA的降解，從而轉錄后調(diào)控靶基因的表達，參與胚胎發(fā)育、增殖、凋亡、代謝及腫瘤發(fā)生等病理生理過程［3］。miR-130a-3p 基因位于11q12.1，可通過堿基互補配對的方式識別靶基因如c-Met 的mRNA，抑制c-Met的翻譯，發(fā)揮抑癌基因的作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-130a-3p 在腎細胞癌［4］、乳腺癌［5］及鼻咽癌［6］等腫瘤中表達降低，并促進腫瘤的增殖、遷移能力。睪丸蛋白聚糖（SPOCK1）基因位于5q31.2，編碼血漿蛋白聚糖的蛋白核心，參與構成硫酸軟骨素和乙酰肝素的肽鏈，功能上發(fā)揮半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用。近年來研究表明，前列腺癌［7］、肺癌［8］等多種腫瘤中SPOCK1 的高表達能夠促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化，導致腫瘤細胞的增殖及浸潤能力增強。有學者在肺腫瘤細胞系A549 中發(fā)現(xiàn)，miR-130a-3p的表達上調(diào)能夠顯著抑制SPOCK1 的表達，進而降低腫瘤細胞的浸潤及遷移能力［9］。因此，miR-130a-3p 與SPOCK1 可能是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。本研究通過檢測BC 組織中miR-130a-3p、SPOCK1的表達，初步探討兩者的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年10月—2020年6月在我院診治的BC 患者94 例。納入標準：初次診治；經(jīng)病理活檢診斷為BC；以往無其他惡性腫瘤病史，無放化療及靶向治療史。排除標準：伴有神經(jīng)源性膀胱、膀胱攣縮等疾?。缓喜乐孛谀蛏诚到y(tǒng)感染或膀胱結核感染；合并精神障礙性疾病，不能配合治療。其中男 55 例、女 39 例；年齡 32～78（46.6 ±6.1）歲；病理分級：高級別 38 例，中低級別56 例；病理類型：移行細胞癌85 例，非移行細胞癌9 例，其中鱗癌4 例，腺癌5 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期62例，Ⅲ～Ⅳ期32例；合并淋巴結轉移33例，不合并淋巴結轉移61 例；合并遠處轉移14 例，不合并遠處轉移80例。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過，且患者均知情同意并簽字。

1.2 組織中miR-130a-3p、SPOCK1 表達檢測 采用熒光定量PCR。取BC腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm 以上，經(jīng)病理檢查明確為正常膀胱黏膜組織）10 mg，應用總RNA 提取試劑盒（北京天根公司）提取組織中總RNA，Narodrop 檢測總RNA 的濃度和純度，OD260/OD280介于1.8～2.1。應用反轉錄試劑盒（北京天根公司）將總RNA反轉錄合成cDNA。miR-130a-3p 熒光定量 PCR 反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 4 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)；反應體系：2×SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。SPOCK1 反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；反應體系：2×SYBR Premix 10 μL，上下游引物各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。miR-130a-3p以U6為內(nèi)參，U6正向序列：5"-AAAGTGGCTAAACGAAGCTGAA-3′，反向序列：5"-GTGGGCAGTGGGTTCTTCTC-3"。SPOCK1 以GAPDH 為內(nèi)參，正向序列：5"-CTGGGCTACACT?GAGCACC-3"，反 向 序 列 ：5"-AAGTGGTCGTT?GAGGGCAATG-3"。 采 用 2-ΔΔCt法計 算 組織 中 miR-130a-3p、SPOCK1的相對表達量。

1.3 miR-130a-3p 與SPOCK1 的結合位點預測 采用 TargetScan Human7.2 在線軟件（http：//www.tar?getscan.org/vert_72/）對miR-130a-3p與SPOCK1的潛在結合位點進行生物信息學預測。結果顯示miR-130a-3p 與SPOCK1 存在潛在的互補結合位點，見圖1。

圖1 miR-130a-3p與SPOCK1的結合位點

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，組間比較用t檢驗；計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗；miR-130a-3p 與 SPOCK1 相對表達量的相關性用Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BC 癌組織及癌旁組織中miR-130a-3p 與SPOCK1 表達比較 BC 癌及癌旁組織中miR-130a-3p 的相對表達量分別為 0.448 ± 0.107、1.120 ±0.208，SPOCK1 mRNA的相對表達量分別為1.763±0.315、0.370± 0.083，兩者相比P均<0.05。

2.2 BC 癌組織中 miR-130a-3p 與 SPOCK1 mRNA表達的關系 BC 癌組織中miR-130a-3p 與SPOCK1 mRNA的表達呈負相關（r=-0.621，P<0.05）。

2.3 BC 癌組織中 miR-130a-3p、SPOCK1 表達與患者臨床病理參數(shù)的關系 見表1。

3 討論

BC是常見的泌尿生殖系統(tǒng)的腫瘤，世界上每年新發(fā)病例達 35.6 萬例，死亡例數(shù)達 14.5 萬例［10］。BC常見的病理類型有膀胱移行細胞癌、鱗癌及腺癌等，其中以膀胱移行細胞癌較為常見。目前BC的治療包括手術治療、放化療及生物治療等，但高級別高分期的患者預后不佳，長期生存時間較短［11］。因此，深入研究BC的發(fā)病機制，對臨床診斷及治療具有重要的意義。BC疾病的發(fā)生是一個多步驟、多階段的過程，與遺傳因素、環(huán)境因素有關，涉及多種癌基因的激活及抑癌基因的失活。近年來大量研究表明，細胞內(nèi)存在的非編碼RNA 分子如miRNA、長鏈非編碼RNA 及環(huán)狀RNA 等，能夠在轉錄水平、翻譯水平調(diào)控靶基因的蛋白表達，影響正常細胞的分化、發(fā)育等生理過程，并參與腫瘤、自身免疫及感染等疾病的發(fā)生發(fā)展［12］。

表1 BC癌組織中miR-130a-3p、SPOCK1表達與患者臨床病理參數(shù)的關系

miRNA 是真核生物細胞內(nèi)的小RNA 分子，能夠在轉錄后水平調(diào)控靶基因的表達。研究表明，腫瘤中存在miR-122、miR-221等多種miRNA異常表達的現(xiàn)象，如miR-221 表達升高能夠直接抑制細胞周期素激酶抑制劑p57的表達，促進腫瘤細胞的G1期向S期轉化，促進腫瘤細胞的惡性增殖［13］。miR-130 家族包括 miR-130a-3p、miR-130b-3p、miR-301a-3p 等，具有共同的編碼基因序列。miR-130a-3p 作為miR-130家族成員，在乳腺癌、BC等腫瘤中存在異常表達下調(diào)的現(xiàn)象，可通過激活磷脂酰肌醇3 激酶/AKT 信號通路的活化，促進惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［5，14］。本研究中BC患者癌組織中miR-130a-3p的相對表達量降低，其機制可能與長鏈非編碼RNA 的表達調(diào)控有關。有學者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中長鏈非編碼RNA HOTAIR可以作為分子海綿結合并抑制miR-130a-3p 的表達，進而導致下游缺氧誘導因子1A 表達上調(diào)，促進腫瘤的惡性進展［15］。此外，癌組織中miR-130a-3p的表達與腫瘤TNM 分期有關，高分期癌組織中miR-130a-3p 表達較低，表明miR-130a-3p 的低表達促進BC 的惡性進展。有學者報道，miR-130a-3p 能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化，細胞表面間質性表型如N-鈣黏素、Vimentin表達增加，導致腫瘤細胞易發(fā)生局部浸潤，引起腫瘤分期升高［16］。

SPOCK1 又稱為Testican-1，是一種細胞外基質的蛋白聚糖，屬于鈣離子結合蛋白多糖家族成員，其能夠影響細胞的發(fā)育分化及增殖等生物學行為，參與細胞之間及細胞與基質之間的相互作用［17］。研究表明，SPOCK1 在非小細胞肺癌、肝癌等惡性腫瘤中異常表達升高，高表達SPOCK1 的腫瘤細胞增殖及遷移能力顯著增強，并促進患者腫瘤的惡性進展［9，18］。本研究中，BC 癌組織中 SPOCK1 mRNA 的表達升高，可能與miRNA 對SPOCK1 的轉錄后表達調(diào)控有關。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-139 能夠直接結合SPOCK1 mRNA 的 3"非編碼區(qū)，導致 SPOCK1 mRNA的穩(wěn)定性降低，抑制SPOCK1 的表達，而腫瘤發(fā)生時miR-139 表達水平降低，導致 SPOCK1 表達升高［18］。BC 癌組織中 SPOCK1 mRNA 的表達與腫瘤 TNM 分期有關，提示SPOCK1 可能作為一種癌基因促進BC的發(fā)生發(fā)展。研究表明，SPOCK1 是細胞外基質重塑的關鍵調(diào)節(jié)因子，其能夠促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化，使腫瘤細胞容易與細胞外基質分離，腫瘤細胞獲得較強的侵襲能力，導致腫瘤分期升高［19］。

本研究Pearson 相關分析結果顯示，BC 癌組織中miR-130a-3p 與SPOCK1 mRNA 表達呈負相關。生物信息學預測結果表明，miR-130a-3p 與SPOCK1存在潛在的互補結合位點。miR-130a-3p 可能通過負向調(diào)控SPOCK1 mRNA 的表達，發(fā)揮抑癌的生物學功能。有學者在體外細胞實驗中證實，miR-130a-3p 可直接結合到SPOCK1 mRNA 的3"非編碼區(qū)，降低SPOCK1 mRNA 的穩(wěn)定性，抑制SPOCK1 的表達，而腫瘤中miR-130a-3p 的表達降低則導致SPOCK1 表達增加，促進腫瘤細胞的增殖及遷移［20］。但BC中miR-130a-3p對SPOCK1表達調(diào)控的機制有待深入研究。

綜上所述，BC 癌組織中miR-130a-3p表達下調(diào)，而 SPOCK1 表達上調(diào)。miR-130a-3p、SPOCK1 的表達與腫瘤TNM 分期有關，有可能作為新的BC 診斷及治療的腫瘤標志物。但BC中miR-130a-3p是否直接通過影響SPOCK1 的轉錄水平的表達，進而影響B(tài)C的惡性進展，有待深入的實驗研究。