胃癌組織中miR-760、BST2的表達變化及意義

蔡永昌，李瑞平

東莞市人民醫(yī)院，廣東東莞 523000

胃癌是威脅全球人類健康的常見惡性腫瘤之一，每年胃癌的病死率約為10%［1］。幽門螺桿菌感染、飲食結(jié)構(gòu)的改變是罹患胃癌的危險因素［2］。胃癌早期臨床癥狀不明顯，部分患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，多伴有轉(zhuǎn)移及周圍組織浸潤，經(jīng)治療后易復(fù)發(fā)且預(yù)后差，5 年生存率低于 30%［3］。因此，有必要探索診斷胃癌的新的有效生物標(biāo)志物。微小RNA（miR?NA）長度約為22 個核苷酸，是小的單鏈非編碼RNA，與靶mRNA 的3"非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，進而調(diào)節(jié)基因表達［4］。有研究表明，miR-760在多種腫瘤組織中表達呈異常狀態(tài)，如肺癌、乳腺癌［5-6］，通過影響腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲能力進而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。骨髓基質(zhì)細胞抗原2（BST2）是一種Ⅱ型跨膜蛋白，也稱為Tetherin、CD317。BST2 廣泛表達于骨髓基質(zhì)細胞、B 細胞、T 細胞及 NK 細胞等［7］。有研究報道，BST2在其他免疫細胞和惡性細胞中也有表達，包括B 細胞慢性淋巴白血病細胞［7］、肺癌細胞［8］。越來越多研究表明，BST2 可調(diào)節(jié)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如乳腺癌、口腔鱗狀細胞癌［9］。本研究通過檢測胃癌組織中miR-760 和BST2 mRNA 的相對表達量來分析兩者與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討兩指標(biāo)在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2018 年 6 月—2019 年 5 月于我院住院治療的胃癌患者82例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)活檢或術(shù)后病理檢查明確診斷為胃癌；均為首次診斷胃癌，從未做過放療或化療治療；臨床病理資料完整并接受隨訪，且均通過患者及家屬的同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他消化系統(tǒng)疾病，如胃炎、胃潰瘍等；患有其他系統(tǒng)疾病或者惡性腫瘤，如食管癌、乳腺癌等；患有免疫功能缺陷疾病。82 例患者，男 56 例，女 26 例；年齡 41～69（55.31 ± 2.2）歲；≥55 歲 37 例，<55 歲 45 例；根據(jù)胃癌病理組織分化結(jié)果，中低分化 51 例、高分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期42例，Ⅱ期27例，Ⅲ期8例，Ⅳ期5例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 40 例；腫瘤直徑<2.5 cm 38 例，≥2.5 cm 44 例。TNM 分期及病理分化程度參考第八版美國癌癥聯(lián)合會標(biāo)準(zhǔn)［10］。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織中miR-760 和BST2 mRNA 檢測 采用熒光實時定量PCR 技術(shù)。收集活檢或術(shù)中獲取的胃癌組織及癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm），應(yīng)用TRIzol 法提取總RNA（RNA 提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司），使用紫外分光光度儀檢測RNA 濃度，符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA 凍存?zhèn)溆?。使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自日本TaKaRa 公司）將提取出的RNA 進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以 cDNA 為模板，使用PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程有限公司）進行PCR擴增，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-760 F：5"-TCTGGGTCTGT?GGGGAGTTG-3"，R：5"-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3"；內(nèi)參GAPDH F：5"-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3"，R：5"-CAAAGTTGTCATGGATGATCC-3"；BST2mRNA F：5"-TGTCGCAATGTCACCCATCT-3"，R：5"-CTTCTCAGTCGCTCCACCTC-3"；內(nèi)參U6 F：5"-GAG?GCACAGCGGAACG-3"，R：5"-CTACCACATAGTC?CAGG-3"。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA 聚合酶，0.5 μL 上下游引物和 8 μL H2O。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，55 ℃ 變性1 min，72 ℃延伸10 s，共40 個循環(huán)。每個樣本至少重復(fù)3次試驗，最后采集熒光信號，以2-ΔΔCt法計算miR-760和BST2 mRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中miR-760、BST2 mRNA表達比較 miR-760 在胃癌及癌旁組織中的相對表達量分別為 0.023 ± 0.008、0.031 ± 0.010，兩者相比P<0.01。BST2 mRNA 在胃癌及癌旁組織中的相對表達量分別為 0.034 ± 0.011、0.017 ± 0.007，兩者相比P<0.01。

2.2 胃癌組織中miR-760、BST2 mRNA 的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 胃癌組織中miR-760、BST2 mRNA的表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 胃癌組織中miR-760 和BST2 mRNA 表達的關(guān)系 胃癌組織中miR-760 和BST2 mRNA 的表達呈負相關(guān)（r=-0.545，P<0.05）。

3 討論

胃癌是最常見消化系統(tǒng)腫瘤之一，是世界上癌癥相關(guān)死亡的第三大誘因［11］，在世界各國發(fā)病率也存在很大差異。食用含高鹽或高硝酸鹽食物、飲酒和吸煙是胃癌發(fā)生的主要危險因素［12］。除了遺傳易感性之外，家族中有胃癌患者亦是高危因素之一。早期胃癌臨床癥狀并不明顯，不易引起重視，因此部分患者診斷時已是晚期，常伴有遠處轉(zhuǎn)移，治愈率低、易復(fù)發(fā)且預(yù)后差。因此，尋找有意義的胃癌生物學(xué)指標(biāo)是醫(yī)療工作者一大重要任務(wù)。

miRNA 是一類小的非編碼單鏈RNA，在多種腫瘤細胞中均表達，如乳腺癌、結(jié)腸癌等［11］，通過調(diào)節(jié)癌細胞的增殖、分化遷移過程，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來研究表明，miRNA 在胃癌中常呈異常表達狀態(tài)，如miR-532 在胃癌中表達上調(diào)，通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進了細胞增殖、遷移及浸潤過程［13］。miR-760亦是miRNA的一種，miR-760在卵巢癌表達上調(diào)，并通過下調(diào)PH 域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶2的表達進而促進卵巢癌細胞的增殖分化過程［14］。但是miR-760 在胃癌中的作用機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-760 的相對表達量低于癌旁組織，且腫瘤TNM 分期越高、細胞分化程度越低或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，胃癌組織中miR-760表達水平越低，說明了miR-760的表達水平與腫瘤TNM 分期、細胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有文獻顯示，過表達的miR-760 可通過下調(diào)下游靶基因ROS1 的表達進而抑制癌細胞的增殖分化及遷移，停滯腫瘤細胞的生長周期［15］；CAO 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-760 可靶向抑制重組人堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ATF 樣蛋白3/激活子蛋白1 信號通路，進而影響抑制靶基因cyclinD1的表達，從而實現(xiàn)抑制腫瘤細胞生長、遷移的作用。而當(dāng)組織中miR-760 表達減少時，其抑制腫瘤細胞增殖的功能減弱，間接的對腫瘤細胞的生長分化起促進作用，促進腫瘤的惡性進展。此外，miR-760 還可抑制其另一靶基因細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（SOCS-3）的表達，進一步下調(diào)SOCS3 的抑制腫瘤細胞增殖的作用，在一定程度上實現(xiàn)了促進腫瘤細胞的增殖分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，提高了腫瘤的臨床分期，增加了腫瘤的惡性程度，給臨床治療帶來了極大挑戰(zhàn)［17］。

BST2 是由180 個氨基酸組成的單次Ⅱ型跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量為35 kD，其基因位于染色體19p13.2。BST2 主要由四部分組成，分別為N 端、C端、跨膜區(qū)及胞外螺旋區(qū)［18］。BST2具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)B 細胞的生長、抑制人類免疫缺陷病毒1 的復(fù)制及抑制不同種包膜病毒，如埃博拉病毒和單純皰疹病毒從細胞釋放的過程［19］。相關(guān)研究表明，BST2參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，如口腔癌、乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌等［20］。但是BST2 在胃癌中的分子作用機制還尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中BST2 mRNA 的相對表達量高于癌旁組織。原因可能為：BST2 是 miR-760 的靶基因之一，miR-760 可與BST2 結(jié)合從而下調(diào)BST2 的表達，當(dāng)胃癌組織中miR-760 表達降低時，其下調(diào)BST2 表達的功能降低，使得癌組織中BST2的表達提高［21］。本研究結(jié)果還顯示，BST2 mRNA 的相對表達量與腫瘤細胞分化程度、TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。BST2核酸序列中有與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）的結(jié)合位點，當(dāng)STAT3 與 BST2 結(jié)合時，激活了 BST2 的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等過程，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到促進作用，提高了腫瘤的臨床分期與惡性程度［18］。另一方面，過表達的BST2可抑制核轉(zhuǎn)錄因子信號通路，促進磷酸化IκBα 和p65 的表達，促進腫瘤細胞的生長，并上調(diào)抗凋亡基因的表達，抑制腫瘤細胞的凋亡過程，從而對腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用［22］。BST2 還可通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達進而促進癌細胞的生長和運動過程，進一步促進腫瘤細胞的遷移進而侵襲［23］。

本研究胃癌組織中miR-760 與BST2 的表達呈負相關(guān)，原因可能是BST2 是miR-760 的靶基因，高表達的miR-760 可以抑制腫瘤細胞的生長，BST2 具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，兩者共同在腫瘤的生長過程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，胃癌組織中miR-760 表達降低，BST2 mRNA 表達升高，兩者均與腫瘤TNM 分期、腫瘤細胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望在胃癌診斷、治療及預(yù)后評估中發(fā)揮重要作用。但兩者在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機制還需要大樣本多中心的研究深入探討。