高通量測(cè)序技術(shù)分析腌漬白菜液中原核微生物群落結(jié)構(gòu)

賈晶晶，易洋，韓睿媛，燕平梅

(太原師范學(xué)院 生物系，山西 晉中 030012)

我國(guó)通過(guò)制作腌漬白菜來(lái)存儲(chǔ)蔬菜的歷史久遠(yuǎn)，甚至可以追溯到商朝[1]。蔬菜腌漬的原理是利用食鹽的高濃度和高滲透壓來(lái)進(jìn)行腌制，研究表明，成品腌漬菜在與空氣隔絕的情況下，在溫度20 ℃以下，食鹽含量在12%～15%時(shí)，能夠保藏180 d以上，并能長(zhǎng)期保藏[2]。高鹽食品之所以能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保存而不致于質(zhì)地軟化，最主要的原因是高食鹽的高滲透壓對(duì)有害微生物的抑制作用，從而可以有效阻止有害微生物分泌的酶對(duì)食品細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[3]。腌漬白菜是以白菜為原料，利用有益微生物的活動(dòng)賦予白菜特殊的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值對(duì)白菜進(jìn)行保藏的一種方式。腌漬蔬菜不僅可以提高蔬菜的利用率，還能使蔬菜的食用保質(zhì)期得以延長(zhǎng)，此外，腌漬蔬菜極具風(fēng)味、易于保存。它制作方法簡(jiǎn)便，風(fēng)味獨(dú)特，適量食用還可調(diào)節(jié)腸胃，增強(qiáng)食欲，能為人體提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]。

我國(guó)腌漬蔬菜產(chǎn)業(yè)從原料選取、發(fā)酵腌漬工藝、產(chǎn)品保藏到加工管理均存在諸多不足[5]。尤其是其中存在的食品安全問(wèn)題[6-7]，嚴(yán)重制約其大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)展。而要促進(jìn)腌漬白菜由自然發(fā)酵到大規(guī)模生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變，對(duì)于自然發(fā)酵腌漬白菜的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究是十分必要的[8-9]。從20世紀(jì)80年代起至今，腌漬白菜中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究一直備受關(guān)注[10]。隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，高通量測(cè)序等技術(shù)逐漸被應(yīng)用于腌漬蔬菜中微生物的研究[11-12], 食鹽在為腌漬白菜增味的同時(shí)，還起到脫水和防止雜菌污染的作用，與腌漬白菜中亞硝酸鹽含量和微生物群落結(jié)構(gòu)息息相關(guān)[13]。本次實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)研究12%食鹽濃度對(duì)腌漬白菜液微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)高食鹽濃度腌漬白菜液中的優(yōu)勢(shì)微生物，對(duì)保障食品安全、提高人民健康水平是十分必要的，為推動(dòng)我國(guó)腌漬白菜產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)展提供了數(shù)據(jù)參考，以促進(jìn)腌漬蔬菜的科學(xué)可持續(xù)發(fā)展[14-15]，更好地為食品安全和人民健康服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

白菜、無(wú)碘食鹽：購(gòu)于山西省太原市解放路永輝超市；DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DYY-6C瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；離心機(jī)：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腌漬白菜的制作

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)自然發(fā)酵方法腌制：將購(gòu)買(mǎi)的新鮮白菜修整、洗凈、瀝干并切分成片狀備用。將選好的腌漬白菜壇用開(kāi)水燙洗2次備用。將預(yù)處理過(guò)的白菜取200 g裝入腌漬白菜壇中，并加入12%濃度的食鹽水直至淹沒(méi)全部白菜，蓋好壇蓋。然后將壇蓋密封，保證發(fā)酵在適宜條件下進(jìn)行。同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵14 d。

1.2.2 樣品采集及樣品DNA的提取

待腌漬白菜發(fā)酵至14 d時(shí)，用5 mL的無(wú)菌移液器分別從腌漬白菜壇的上、中、下三部分的隨機(jī)位置各吸取12 mL發(fā)酵液，共計(jì)36 mL發(fā)酵液于離心管中，設(shè)置10000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用1.5 mL的EP管存放離心得到的菌體。將3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)得到的菌體均勻混合，備用。最后根據(jù)DNA提取試劑盒的要求對(duì)收集到的混合菌體進(jìn)行DNA的提取。提取成功后用0.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并測(cè)定其DNA的濃度。

1.2.3 高通量測(cè)序

將提取得到的DNA樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)97%相似性，將非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)。然后采用RDP Classifier 貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)12%食鹽濃度腌漬白菜的微生物在不同水平的群落組成。利用Mothur軟件繪制稀釋性曲線(xiàn)，利用QIIME軟件計(jì)算樣品的各種多樣性指數(shù)，利用Excel軟件構(gòu)建群落分布柱狀圖、數(shù)據(jù)分析表等。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌漬白菜中微生物群落結(jié)構(gòu)組成

分別在不同水平對(duì)樣品的群落組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果表明：樣品中共有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)和芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)6個(gè)菌門(mén)。整理分析12%食鹽濃度發(fā)酵的腌漬白菜中微生物群落在門(mén)水平的相對(duì)含量數(shù)據(jù)表(見(jiàn)表1)和柱狀圖(見(jiàn)圖1)。

表1 12%食鹽濃度的腌漬白菜微生物群落 在門(mén)水平上的相對(duì)含量

圖1 12%食鹽濃度的腌漬白菜微生物群落 在細(xì)菌門(mén)水平上的相對(duì)含量Fig.1 The relative content of microbial community of pickled Chinese cabbage at the phylum level with 12% salt concentration

由表1和圖1可知，變形菌門(mén)(67.01%)含量最高，厚壁菌門(mén)含量(32.39%)次之，芽單胞菌門(mén)含量最低。由此認(rèn)為，12%食鹽濃度腌漬白菜中變形菌門(mén)為最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。

表2 12%食鹽濃度腌漬白菜微生物群落 在綱、目水平上的相對(duì)含量Table 2 The relative content of microbial community of pickled Chinese cabbage at the class and order levels with 12% salt concentration

通過(guò)對(duì)樣品在綱和目水平的微生物群落分布的統(tǒng)計(jì)分析(見(jiàn)表2)可知，在變形菌門(mén)中，主要優(yōu)勢(shì)菌綱為Gammaproteobacteria，其含量高達(dá)99.17%，其中Enterobacteriales(72.05%)含量最高，Alphaproteobacteria含量較少，未統(tǒng)計(jì)到Deltaproteobacteria。而厚壁菌門(mén)中Bacilli(99.99%)為主要優(yōu)勢(shì)菌綱，該綱中Lactobacillales(86.05%)含量最高，Clostridia含量較少。變形菌門(mén)與厚壁 菌門(mén)的相對(duì)含量高達(dá)99.40%，再次是擬桿菌門(mén)(0.57%)，其中均為Bacteroidia，Sphingobacteriales的含量最高，未檢測(cè)到Bacteroidales細(xì)菌。而放線(xiàn)菌門(mén)、藍(lán)藻菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)的含量都很少，約占總含量的0.02%。

12%食鹽濃度發(fā)酵的腌漬白菜中細(xì)菌在屬水平上的分布見(jiàn)圖2。

圖2 12% 食鹽濃度腌漬白菜水中的細(xì)菌 在屬水平上的相對(duì)含量Fig.2 The relative content of bacteria in the pickled Chinese cabbage liquid at the genus level with 12% NaCl concentration

由圖2可知，乳球菌屬(Lactococcus)含量最高，為最優(yōu)勢(shì)菌屬，約占總體的26.45%。第二優(yōu)勢(shì)菌屬為普羅威登斯菌屬(Providencia)，含量約占樣本總體的24.89%。再其次為腸桿菌屬(Enterobacter)，約占總體的21.28%。另外，腸桿菌科中還有未分類(lèi)的菌屬，占樣本總數(shù)的12.06%。此外，還有Lelliottia(1.23%)，Acinetobacter(1.29%)，Delftia(1.29%)，Comamonas(1.22%)，Weissella(0.26%)，Bacillus(3.62%)等菌屬。樣本微生物群落中Aerococcus，Christensenellaceae_R-7_group，Bacteroides，Rikenellaceae_RC9_gut_group，Cloacibacterium，Bifidobacterium，Cutibacterium，norank等菌屬含量均為0。

2.2 腌漬白菜中微生物多樣性分析

從所得有效序列中隨機(jī)選取一定數(shù)量進(jìn)行稀釋曲線(xiàn)的繪制(見(jiàn)圖3)，可以看到曲線(xiàn)趨于平緩，即認(rèn)為測(cè)序結(jié)果能夠基本反映出腌漬白菜中細(xì)菌的豐富度及多樣性。

圖3 不同食鹽濃度樣品的稀釋曲線(xiàn)Fig.3 The dilution curves of samples with different salt concentration

通過(guò)分析樣品測(cè)序所得序列，計(jì)算樣品的各項(xiàng)多樣性指數(shù)，見(jiàn)表3。

表3 12% 食鹽濃度腌漬白菜中Alpha多樣性指數(shù)Table 3 The Alpha diversity indexes of pickled Chinese cabbage with 12% NaCl concentration

由表3可知，12%食鹽濃度腌漬白菜的香農(nóng)指數(shù)較低。而12%食鹽濃度腌漬白菜的辛普森指數(shù)較高。綜合分析認(rèn)為，12%食鹽濃度腌漬白菜的微生物多樣性較低。原因可能是食鹽濃度的不同造成腌漬白菜水的滲透壓不同，影響了發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。

3 結(jié)論

本文通過(guò)高通量測(cè)序研究12%食鹽濃度腌漬白菜液中原核微生物群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，12%食鹽濃度發(fā)酵的腌漬白菜中包含6個(gè)菌門(mén)，其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)和桿菌(Bacilli)為其主要優(yōu)勢(shì)菌綱，普羅威登斯菌屬(Providencia)和乳球菌屬(Lactococcus)為最優(yōu)勢(shì)菌屬。