凝膠色譜-HPLC及LC/MS/MS法測定食品中蘇丹紅染料

彭飛進，楊云華，李艷梅，李芹超，高小林，段加權(quán)，劉黔

(云南華測檢測認(rèn)證有限公司，昆明 650214)

蘇丹紅屬偶氮系列化工合成染料，2008年被列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》第一批“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單”，名單中蘇丹紅被列入可能違法添加至辣椒粉中作為著色使用，2011年公布第五批名單時，將蘇丹紅可能違法添加的產(chǎn)品類別進行修訂，“產(chǎn)品類別”中增加“含辣椒類的食品(辣椒醬、辣味調(diào)味品)”，近年來國家對含辣椒、蛋黃的食品在監(jiān)督抽檢時均要求檢測蘇丹紅，而辣椒類產(chǎn)品是我國常見的食品之一[1-2]，因此開發(fā)一種準(zhǔn)確、高效的檢測方法有利于篩查食品中蘇丹紅非法使用情況，有利于保障食品安全。

目前檢測蘇丹紅的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19681—2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方法 高效液相色譜法》采用正己烷提取，固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀分析，該方法的難點在于手動裝填氧化鋁層析柱，受人員熟練度和試劑等不確定度影響較大，采用高效液相色譜儀檢測時，如果蘇丹紅I、II、III、IV分離較差，將影響定性和定量，其他已發(fā)表的關(guān)于蘇丹紅檢測方法的主要以GPC凈化高效液相色譜檢測蘇丹紅為主[3-7]，少數(shù)為固相萃取柱凈化高效液相色譜檢測和固相萃取柱凈化LC/MS/MS檢測等[8-10]，本文利用凝膠色譜較好的分離凈化功能，對辣椒粉、辣椒醬、腐乳、辣條、鴨蛋、橙子等多種食品進行檢測，實驗結(jié)果顯示回收率在75%～120%之間，同時采用高效液相色譜(HPLC)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS/MS)分析，可以有效排除假陽性，靈敏度高，最低檢出限為5 μg/kg。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；ΜPLC-XEVO TQ-S Micro液質(zhì)質(zhì)聯(lián)用儀(LC/MS/MS) 美國沃特世公司；N-1300D-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會社；LE204E分析天平(精度0.1 mg) 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 試劑與材料

蘇丹紅I、II、III標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(濃度100 μg/mL)：購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所；蘇丹紅IV：購自Dr. Ehrenstorfer公司；正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯(色譜純)：購自上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆灰译?、甲?色譜純)：購自上海安譜實驗科技股份有限公司；其他所有試劑均為分析純；實驗室用水為超純水；樣品購自于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.3 實驗條件

液相色譜法條件：InertSustain C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱溫 40 ℃，進樣量 40 μL，流動相為乙腈和水(92∶8)等度洗脫，流速1.0 mL/min，PDA檢測器，檢測波長518 nm。

液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜條件：ACQΜITY ΜPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)，進樣量3 μL，流動相為甲醇(A)和4 mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)(B)梯度洗脫，洗脫程序見表1，流速0.3 mL/min，電噴霧正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，離子源溫度500 ℃，噴霧電壓3000 V，脫溶劑溫度500 ℃，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表1 LC/MS/MS流動相梯度洗脫程序Table 1 LC/MS/MS mobile phase gradient elution procedure

表2 蘇丹紅質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 The mass spectrometry parameters of Sudan red

1.4 前處理過程

稱取1.0 g(準(zhǔn)確至0.01 g)樣品于離心管中，加20 mL水與正己烷渦旋混勻后，超聲30 min，取出，以4000 r/min離心5 min, 取出正己烷層于150 mL雞心瓶中，再在殘渣中加入20 mL正己烷勻漿，渦旋混勻，4000 r/min離心5 min，合并2次正己烷，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，用5 mL環(huán)己烷∶乙酸乙酯為1∶1復(fù)溶殘渣，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后，上GPC儀器乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)凈化，凈化后液體轉(zhuǎn)移至150 mL雞心瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，用乙腈定容1 mL，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后分別上HPLC和LC/MS/MS檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜檢測情況

標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度及編號：蘇丹紅4項-5(180809 01)10 mg/L。液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線表和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制表分別見表3和表4，蘇丹紅I、II、III、IV曲線圖分別見圖1～圖4。

表3 液相色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線表Table 3 The standard curve table for liquid chromatography

表4 液相色譜標(biāo)準(zhǔn)溶液配制表Table 4 Liquid chromatography standard solution preparation table

圖1 蘇丹紅I曲線圖Fig.1 The curve graph of Sudan red I

圖2 蘇丹紅II曲線圖Fig.2 The curve graph of Sudan red II

圖3 蘇丹紅III曲線圖Fig.3 The curve graph of Sudan red III

圖4 蘇丹紅IV曲線圖Fig.4 The curve graph of Sudan red IV

選取陰性基質(zhì)鴨蛋、辣椒醬、辣椒粉、腐乳、辣條、橙子分別添加3個不同濃度的蘇丹紅標(biāo)液做回收率實驗，實驗結(jié)果見表5～表10。

表5 鴨蛋回收率結(jié)果表Table 5 The recovery rates of duck eggs

表6 辣椒醬回收率結(jié)果表Table 6 The recovery rates of chili sauce

表7 辣椒粉回收率結(jié)果表Table 7 The recovery rates of paprika

表8 腐乳回收率結(jié)果表Table 8 The recovery rates of fermented bean curd

表9 辣條回收率結(jié)果表Table 9 The recovery rates of spicy strip

表10 橙子回收率結(jié)果表Table 10 The recovery rates of oranges

前處理未過GPC凈化和過GPC凈化分別見圖5和圖6。

圖5 未過GPC凈化的樣品和標(biāo)物對比圖Fig.5 Comparison diagram of samples and standard substances before GPC purification

圖6 過GPC凈化的樣品圖Fig.6 The diagram of samples after GPC purification

2.2 液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜檢測情況

LC/MS/MS標(biāo)準(zhǔn)曲線表(曲線濃度與液相一致)和蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖分別見圖7～圖10，相關(guān)系數(shù)在0.99以上，蘇丹紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖見圖11。

圖7 LC/MS/MS蘇丹紅I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖Fig.7 The curve graph of Sudan red I standard substances by LC/MS/MS

圖8 LC/MS/MS蘇丹紅II標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖Fig.8 The curve graph of Sudan red II standard substances by LC/MS/MS

圖9 LC/MS/MS蘇丹紅III標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖Fig.9 The curve graph of Sudan red III standard substances by LC/MS/MS

圖10 LC/MS/MS蘇丹紅IV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線圖Fig.10 The curve graph of Sudan red IV standard substances by LC/MS/MS

圖11 LC/MS/MS蘇丹紅I、II、III、IV標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig.11 The mass spectrograms of Sudan red I, II, III, IV standard substances by LC/MS/MS

選取陰性基質(zhì)辣椒醬、辣椒粉、腐乳分別添加3個不同濃度的蘇丹紅標(biāo)液做回收率實驗，實驗結(jié)果見表11～表13。

表11 辣椒醬回收率結(jié)果表Table 11 The recovery rates of chili sauce

表12 辣椒粉回收率結(jié)果表Table 12 The recovery rates of paprika

表13 腐乳回收率結(jié)果表Table 13 The recovery rates of fermented bean curd

根據(jù)上述結(jié)果分析，液相色譜檢測時選取518 nm波長比國家標(biāo)準(zhǔn)蘇丹紅II、III、IV的波長520 nm的響應(yīng)要高，因此可以提高檢出限，不用GPC凈化時，在基質(zhì)比較復(fù)雜的樣品如辣椒醬中，容易出現(xiàn)蘇丹紅IV干擾，出現(xiàn)假陽性，用GPC凈化效果很好，無雜質(zhì)干擾，液相檢測相應(yīng)回收率和穩(wěn)定性較好，液質(zhì)質(zhì)基質(zhì)效應(yīng)較大，回收率偏高，但是定性準(zhǔn)確，如果通過凈化消除雜質(zhì)干擾時，可以通過液質(zhì)質(zhì)選擇質(zhì)譜離子來定性，因此有檢出蘇丹紅時，可以用兩種儀器同時定性和定量。

3 結(jié)論

利用凝膠色譜凈化，對鴨蛋、辣椒粉、辣椒醬、腐乳、辣條、橙子等多種食品進行檢測，實驗結(jié)果顯示回收率在75%～120%之間，高效液相色譜(HPLC)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC/MS/MS)對辣椒粉、辣椒醬和腐乳分析回收率均較好，可以有效排除假陽性，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是蘇丹紅檢測的有效方法。