雞皮刺螨病的PCR診斷及18S rRNA·ITS·28S rRNA基因序列分析

劉成倩 李紅 高駿

摘要 江蘇某蛋雞場發(fā)生體外寄生蟲感染，經(jīng)臨檢癥狀觀察及鏡檢疑似雞皮刺螨病。根據(jù)GenBank 中已登錄的雞皮刺螨基因組18S rRNA、ITS、28S rRNA基因的序列設(shè)計1對引物，采用PCR方法及測序鑒定確診該體外寄生蟲為雞皮刺螨。對18S rRNA、ITS、28S rRNA基因序列進行了比對分析，并給出了治療和防控建議。

關(guān)鍵詞 雞皮刺螨;診斷;序列分析

中圖分類號 S831.7 ?文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）18-0104-03

Abstract An ectoparasite infection occurred in a laying hen farm in Jiangsu Province. It was suspected to be Dermanyssus gallinae disease by clinical inspection and microscopically observation. A pair of primers were designed based on the 18S rRNA，ITS，28S rRNA sequence of D. gallinae registered in GenBank.The ectoparasite was identified to be D. gallinae by PCR and sequencing.The sequences of 18S rRNA，ITS，28S rRNA were compared and analyzed， and some treatment and recommendations of control measures were given.

Key words Dermanyssus gallinae;Diagnosis;Sequence analysis

雞螨病是由多種對雞有侵襲、寄生特性的螨類引起發(fā)生的，以雞群表現(xiàn)為易驚恐、食欲減退、貧血、消瘦等癥狀的雞體內(nèi)外寄生螨病的統(tǒng)稱[1-2]。螨蟲在全球許多地區(qū)流行，對養(yǎng)雞行業(yè)造成了威脅，并影響雞的健康和福利。引起雞螨病的螨蟲種類很多，較常見的螨蟲包括雞皮刺螨和北方域螨[3]。

雞皮刺螨（Dermanyssus gallinae）因吸血后會變成紅色又稱為血螨或紅螨， 是寄生在雞表皮上、附著于羽毛上的一種體外寄生蟲， 以泄殖腔周圍寄生較為常見，大量的螨蟲寄生易導(dǎo)致尾羽聚成束狀[4-5]。由于蟲體可以脫離雞體，在自然環(huán)境中長期存活，常規(guī)消毒藥很難殺滅它，所以會在一定區(qū)域內(nèi)長時間發(fā)生流行。雞皮刺螨不僅引起雞只騷動不安、采食量下降、貧血、生產(chǎn)性能下降，而且雞皮刺螨可以攜帶并傳播多種病原體（如沙門氏菌等），也會叮咬飼養(yǎng)人員，對人類的健康造成威脅[6]，因此對雞螨蟲的防治要引起高度重視。規(guī)模化養(yǎng)殖場雞只飼養(yǎng)密度高，溫濕度較為恒定，更易于螨蟲的生存繁殖，經(jīng)常發(fā)生暴發(fā)，嚴(yán)重影響蛋雞及肉雞的生長、生產(chǎn)性能。江蘇某雞場發(fā)生體外寄生蟲感染，通過樣品采集、顯微鏡鏡檢及PCR檢測比對分析確診為雞皮刺螨病。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 用蘸有水的棉簽，黏附雞槽或雞體上的蟲體，放入容器中密封保存。

1.2 顯微鏡觀察 將蟲體置于干凈的載玻片上，滴加1滴松柏油，加上蓋玻片，使蟲體散開，在顯微鏡下觀察。

1.3 雞皮刺螨PCR檢測

1.3.1 引物的設(shè)計與合成及DNA抽提。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已公開的雞皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因堿基序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計了l對特異性引物，引物預(yù)擴增片段大小為519 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。特異性引物序列如下：F1為TAGGTGAACCTGCGGAAGGATC;R1為AGTTCAGCGGGTCGTCACACTTG。DNA 的抽提按照DNA抽提說明書進行 。

1.3.2 PCR擴增。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：DNA模板2.0 μL，10×Buffer（不含Mg2+） 5.0 μL， MgSO4 ?4.0 μL，dNTP（2 mmol/L）5.0 ?μL，F(xiàn)1/R1（10 μmol/L）各1.5 μL，KOD-Plus 酶 2.0 ?μL，ddH2O 29.0 ?μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，55 ℃ 35 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)35次;最后 68 ℃ 延伸 10 min。

1.4 序列分析和數(shù)據(jù)處理

將擴增結(jié)果中條帶亮的PCR產(chǎn)物送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行純化測序。 用DNASTAR 軟件包中的SeqMan 軟件對獲得的基因序列進行校對和編輯，并在 NCBI網(wǎng)站的GenBank中搜尋最相關(guān)序列進行比對分析，使用DNAstar MegAlign 軟件進行同源性分析及進化樹建構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨診癥狀

江蘇某蛋雞場發(fā)生體外寄生蟲感染，雞只喙食羽毛，雞群表現(xiàn)躁動不安;雞只出現(xiàn)貧血、消瘦，減蛋及蛋品質(zhì)下降;在雞蛋上可見迅速移動的小黑點。

2.2 顯微鏡觀察結(jié)果

蟲體呈淡紅色，吸血后呈棕黑色，長橢圓形，后部略寬，體表布滿短絨毛，有4對長足，假頭前生有細(xì)長針狀螯枝1對（圖1）。

2.3 PCR檢測結(jié)果 以抽提的蟲體基因組DNA為模板，以F1/R1為引物進行PCR擴增，得到的擴增片段約519 bp（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 雞皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因序列的測序

經(jīng)PCR產(chǎn)物測序，得到雞皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因浙江分離株基因序列，命名為JS-D.gallinae（圖3）。

2.5 序列分析結(jié)果

將獲得的JS-D.gallinae基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似的核苷酸用DNAMAN 軟件進行同源性比較和進化樹分析。從同源性結(jié)果來看，JS-D.gallinae序列與日本地區(qū)的LCO34921、LCO34936、LCO34939、LCO34949、LCO34950、LCO34953TO同源率達(dá)100%。從系統(tǒng)進化樹來看，JS-D.gallinae株和日本地區(qū)的LCO34921、LCO34936、LCO34939、LCO34949、LCO34950、LCO34953TO在同一進化分支，親緣關(guān)系相同（圖4、5）。

3 討論

雞皮刺螨的感染會影響蛋雞的產(chǎn)量，降低飼料轉(zhuǎn)化率，會導(dǎo)致禽類變得不安和煩躁，但雞皮刺螨是一種非常有彈性的禽類寄生蟲，繁殖周期的速度與溫度有關(guān)，如果溫度適宜，可迅速大量增殖[7]。由于螨的特殊生物習(xí)性，傳播快，很難從雞舍內(nèi)清除，必須采取綜合性防治策略[8-9]。對于嚴(yán)重感染的群體，可用高效、低毒殺螨劑對感染雞全身浸泡滅蟲，對雞舍、室內(nèi)墻壁可用防蟲劑全方位濕淋噴霧處理。

傳統(tǒng)的雞皮刺螨病的診斷方法一般都是通過形態(tài)學(xué)觀察。為了從分子水平上來確診[10]，根據(jù)雞皮刺螨18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因序列設(shè)計了1對特異性引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出大小519 bp的片段，經(jīng)序列分析可以看出該例雞皮刺螨序列與其他地區(qū)序列的同源性為99.6%～100%，同源性很高。18S rRNA、ITS、28S rRNA 基因序列的保守性很強，可作為診斷雞皮刺螨病的基因序列，這為探索出適于診斷雞皮刺螨病的方法提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

江蘇某蛋雞場發(fā)生的體外寄生蟲感染確診為雞皮刺螨病，建議采取綜合性防治策略。

參考文獻

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