款冬花多糖通過調(diào)控miR?99a／PI3K／Akt 通路影響食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

劉宜峰 楊 華 曹 磊 鄭楊楊

（海南省中醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科， 海南?？?70203）

食管癌是世界上最致命的惡性腫瘤之一，在過去的幾十年里，食管癌發(fā)病率急劇上升。盡管食管癌患者的管理和治療有所改善，但總體的5 年生存率（10%） 和5 年食管癌切除術(shù)后生存率（15%～40%） 仍然很差［1］。因此，尋找更有效和合適的治療劑，以改善食管癌患者的存活是十分必要的?？疃ㄋ幉氖蔷湛浦参锟疃琓ussilago farfaraL.的干燥花蕾，具有潤肺下氣、止咳化痰的功效，可用于治療新久咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血［2］。作為款冬花的活性成分之一，款冬花多糖具有抗腫瘤作用［3］，能夠抑制肺腺癌的增殖，誘導(dǎo)其凋亡［4］。然而，款冬花多糖對(duì)食管癌的影響鮮有報(bào)道。microRNA 是一類內(nèi)源性非編碼RNA，在食管癌等多種癌癥中異常表達(dá)［5?6］。miR?99a 被廣泛報(bào)道在多種癌癥中具有抑癌作用。miR?99a 的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌組織中被顯著抑制，miR?99a 過表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，阻斷G1／S 期轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過miR?99a 抑制PI3K／Akt／mTOR 信號(hào)通路，抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展［7］。在 101 例食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC） 手術(shù)組織樣本和3 個(gè)細(xì)胞系中，證實(shí)了miR?99a／100 的下調(diào)，miR?99a 和miR?100 的過表達(dá)通過誘導(dǎo)細(xì)胞株凋亡，抑制細(xì)胞增殖［8］。PI3K／Akt／mTOR 通路在細(xì)胞生物學(xué)中具有重要的調(diào)控作用，包括翻譯、轉(zhuǎn)錄和自噬，該通路的失調(diào)參與食管癌的發(fā)病機(jī)制、發(fā)展、預(yù)后［9］。姜黃素通過上調(diào)miR?145 表達(dá)和抑制PI3K／Akt／mTOR 通路抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡［10］。姜黃素的干預(yù)可以抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO?Rb50 和Y79 細(xì)胞的存活、菌落形成、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的抗腫瘤活性是通過上調(diào)miR?99a，從而抑制JAK／STAT 通路來實(shí)現(xiàn)的［11］。姜黃素上調(diào)miR?99a 表達(dá)，抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展，但是關(guān)于款冬花多糖是否通過調(diào)控miR?99a、PI3K／Akt 信號(hào)通路來影響食管癌的增殖、遷移和侵襲，這方面的資料鮮見報(bào)道。因此，本研究以食管癌細(xì)胞Eca109 為對(duì)象，評(píng)價(jià)款冬花多糖在細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用，并結(jié)合miR?99a 和PI3K／Akt 信號(hào)通路，探索其潛在的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 食管癌細(xì)胞Eca109 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑 中藥款冬花（批號(hào)1903203） 由海南壽南山參業(yè)有限公司生產(chǎn)，海南新星參茸藥業(yè)有限公司供貨；RPMI?1640 培養(yǎng)基（批號(hào)31870082） 購自美國Gibco 公司；胎牛血清（批號(hào)SH30396） 購自美國Hyclone 公司；RIPA裂解液 （批號(hào) R0278）、噻唑藍(lán) （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） （批號(hào)M2128） 購自美國Sigma 公司；Matrigel 基質(zhì)膠（批號(hào)356234） 購自美國BD 公司；β 肌動(dòng)蛋白（β?actin） 抗體 （批號(hào)4970）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix metalloprotease 2，MMP2） （批號(hào)4022）、基質(zhì)金屬蛋白酶9 （Matrix metalloprotease 9，MMP9） （批號(hào)3852）、細(xì)胞周期蛋白D1 （Cyclin D1） （批號(hào)2978）、磷酸化磷脂酰肌醇?3 激酶（p?PI3K） （批號(hào)17366）、磷酸化蛋白激酶B （p?Akt） （批號(hào)4058） 抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（批號(hào)ZDR?5306） 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Tris?HCl?Tween 緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）（批號(hào)C520009?0500） 購自上海生工生物工程公司；TRIzol（批號(hào)15596026）、Lipofectamine 2000 （批號(hào)11668019） 購自美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)4366596） 購自美國Thermo Fisher 公司，miR?con、miR?99a、anti?miR?con、anti?miR?99a 購自上海吉瑪生物公司。

2 方法

2.1 款冬花多糖制備 款冬花藥材粉碎成粉末，取過60目篩的藥材粉末，按趙鵬等［12］的方法超聲提取款冬花多糖。料液比1 ∶27，溫度68 ℃，時(shí)間36 min，提取3 次。采用苯酚?硫酸法進(jìn)行測(cè)定，多糖提取率＝ （款冬花多糖質(zhì)量／款冬花藥材質(zhì)量） ×100%，多糖提取率為1.97%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 Eca109 細(xì)胞加入RPMI?1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37 ℃、3% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，胰酶消化3～5 min，以1 ∶2 的比例接種傳代。將Eca109 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（不加任何處理的Eca109 細(xì)胞）、款冬花多糖組（10、20、40、80、160 mg／L 款冬花多糖），款冬花多糖處理Eca109 細(xì)胞24 h。

2.3 MTT 法檢測(cè)Eca109 細(xì)胞存活 使用胰酶消化Eca109細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104／mL，接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h?？疃ǘ嗵翘幚?4 h 后，棄去原有培養(yǎng)液，以100 μL ／孔加入MTT 溶液（5 g／L），培養(yǎng)4 h，棄去原有液體，加入200 μL／孔的二甲基亞砜（DMSO），置37 ℃搖床持續(xù)10 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞吸光度值（OD），檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為490 nm。細(xì)胞存活率＝ ［（OD給藥組／OD對(duì)照組）］ ×100%。

2.4 Transwell 法檢測(cè)Eca109 細(xì)胞遷移和侵襲 Eca109 細(xì)胞遷移能力測(cè)定： 使用不含血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度為5×105／mL，吸取100 μL 于上室；下室加入含血清的RPMI?1640 培養(yǎng)基500 μL 作為趨化因子，培養(yǎng)24 h，棉簽拭去未穿膜的Eca109 細(xì)胞，4% 甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，記錄遷移細(xì)胞數(shù)。Eca109 細(xì)胞侵襲能力測(cè)定，取Matrigel 膠100 μL 加入不含血清RPMI?1640 培養(yǎng)基500 μL，混勻后添加50 μL 于上室，靜置3～4 h，后續(xù)操作與Eca109 細(xì)胞遷移能力測(cè)定相同。

2.5 Western blot 檢測(cè)MMP2、MMP9、Cyclin D1、p?PI3K、p?Akt 蛋白表達(dá) 在冰上使用RIPA 裂解液提取Eca109 細(xì)胞蛋白，蛋白加入上樣緩沖液，變性后，進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳 （Sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS?PAGE），轉(zhuǎn)至PVDF膜，之后加5%脫脂奶粉，封閉1 h。加入一抗MMP2 （1 ∶1 000）、MMP9 （1 ∶1 000）、Cyclin D1 （1 ∶1 000）、p?PI3K （1 ∶1 000）、p?Akt （1 ∶1 000），4 ℃過夜。TBST 溶液洗膜3 次，15 min／次，加入二抗（1 ∶5 000） 孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次，15 min／次，加入化學(xué)發(fā)光液避光顯色，β?actin 作為內(nèi)參蛋白，分析MMP2、MMP9、Cyclin D1、p?PI3K 和p?AKT 蛋白表達(dá)。

2.6 RT?PCR 檢測(cè)miR?99a 表達(dá) 使用TRIzol 試劑提取Eca109 細(xì)胞總RNA，cDNA 的合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列miR?99a 正向 5′?AGAGCAACCCGTAGATCCGA?3′，反向 5′?CAGTG CAGGGTCCGAGGT?3′。U6 正向5′?GCGCGTCGT?GAAGCGTTC?3′，反向5′?GTGCAGGGTCCGAGGT?3′。miR?99a 的表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Eca109 細(xì)胞以1×105／mL 接種于6 孔板，待其70%融合時(shí)，按照Lipofectamine 2000 試劑說明書的指示，將miR?con、miR?99a、anti?miR?con、anti?miR?99a 轉(zhuǎn)染入Eca109 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染anti?miR?con、anti?miR?99a 的細(xì)胞以80 mg／L 款冬花多糖處理24 h。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以（） 表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用SNK?q 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對(duì)Eca109 細(xì)胞存活率的影響 如表1 所示，與對(duì)照組比較，10、20、40、80、160 mg／L 款冬花多糖減少Eca109 細(xì)胞存活率（P＜0.05）。

表1 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖的影響（， n＝9）

表1 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖的影響（， n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

3.2 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對(duì)Eca109 細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對(duì)照組比較，40、80 mg／L 款冬花多糖抑制Eca109 細(xì)胞遷移、侵襲（P＜0.05），抑制Eca109 細(xì)胞中MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 Western Blot 檢測(cè)MMP2、MMP9 蛋白的表達(dá)

表2 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖抑制食管癌細(xì)胞Eca109 遷移和侵襲（， n＝9）

表2 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖抑制食管癌細(xì)胞Eca109 遷移和侵襲（， n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

3.3 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 中miR?99a 表達(dá)的影響 如表3 所示，40、80 mg／L 款冬花多糖較對(duì)照組增加Eca109 細(xì)胞內(nèi)miR?99a 的表達(dá) （P＜0.05）。

表3 不同質(zhì)量濃度款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 中miR?99a 表達(dá)的影響（x ±s， n＝9）

3.4 過表達(dá)miR?99a 抑制食管癌細(xì)胞Eca109 增殖、遷移和侵襲 如表4 所示，轉(zhuǎn)染后miR?99a 表達(dá)高于miR?con 組（P＜0.05），表明成功構(gòu)建過表達(dá)miR?99a 的Eca109 細(xì)胞。與miR?con 組比較，過表達(dá)miR?99a 降低Eca109 細(xì)胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)（P＜0.05），減少細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 Western Blot 檢測(cè)高表達(dá) miR?99a 時(shí)CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白的表達(dá)

表4 過表達(dá)miR?99a 對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表4 過表達(dá)miR?99a 對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與miR?con 組比較，*P＜0.05。

3.5 低表達(dá)miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響 與對(duì)照組比較，款冬花多糖促進(jìn)miR?99a 表達(dá)，抑制Cyclin D1、MMP2、MMP9表達(dá)，降低細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）。與款冬花多糖＋anti?miR?con 組比較，款冬花多糖＋anti?miR?99a 組減少miR?99a 表達(dá) （P＜0.05），提高Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)（P＜0.05），并增加細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）。見圖3、表5。

3.6 低表達(dá)miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 PI3K／AKT 信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組比較，款冬花多糖減少Eca109 細(xì)胞中p?PI3K、p?Akt 蛋白表達(dá)（P＜0.05）；相較于款冬花多糖＋anti?miR?con 組，款冬花多糖＋anti?miR?99a 組提高Eca109 細(xì)胞中p?PI3K 和p?Akt 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見圖4、表6。

4 討論

圖3 Western Blot 檢測(cè)Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)

食管癌是消化道常見的原發(fā)性惡性腫瘤。2018 年，按發(fā)病率（572 034 例新發(fā)病例） 和總死亡率（508 585 例死亡病例） 排名，食管癌居于全球癌癥的第7 位，大約70%的病例發(fā)生于男性，全世界的發(fā)病率和死亡率在兩性之間存在2～3 倍的差異［13］。按區(qū)域劃分，東亞的發(fā)病率最高，中國和蒙古的發(fā)病率在世界上排名前5［13］。食管癌最常見的2 種組織學(xué)亞型為ESCC 和食管腺癌（oesophageal adeno?carcinoma，EAC）［14］。目前食管癌的治療包括手術(shù)、化療和放化療，然而所有這些方法對(duì)該病的影響有限［15］，因此，有必要尋找新的食管癌治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用，作用機(jī)制與調(diào)控miR?99a／PI3K／Akt 通路有關(guān)。

圖4 Western Blot 檢測(cè)p?PI3K 和p?Akt 蛋白的表達(dá)

款冬花是我國傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，含有黃酮類、多糖類、生物堿類、酚酸類等化學(xué)成分［16］?？疃ǘ嗵翘崛∽钥疃?，具有抗氧化［17］、抗腫瘤［18］等活性。Safonova 等［19］對(duì)Lewis 肺癌C57Bl／6 小鼠進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，在常規(guī)順鉑／紫杉醇復(fù)合化療中添加款冬花多糖可減輕抗腫瘤治療引起的中性粒細(xì)胞減少，提高治療效率；款冬花多糖對(duì)成粒細(xì)胞的刺激作用可與重組腦脊液神經(jīng)源相媲美。Qu 等［20］從款冬花花蕾中分離得到一種多糖TFPB1，TFPB1 由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，比例為13 ∶13 ∶1 ∶7 ∶12；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TFPB1能抑制非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，款冬花多糖明顯抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，顯現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用，這些發(fā)現(xiàn)提供了一種治療人類食管癌的潛在策略。

表5 低表達(dá)miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

表5 低表達(dá)miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 增殖、遷移和侵襲的影響（， n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與款冬花多糖＋anti?miR?con 組比較，＃P＜0.05。

表6 低表達(dá)miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 中p?PI3K 和p?Akt 蛋白表達(dá)的影響（， n＝9）

表6 低表達(dá)miR?99a 可以部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 中p?PI3K 和p?Akt 蛋白表達(dá)的影響（， n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與款冬花多糖＋anti?miR?con 組比較，＃P＜0.05。

數(shù)據(jù)顯示，款冬花多糖可以提高Eca109 細(xì)胞miR?99a表達(dá)，猜想款冬花多糖抑制食管癌功能與調(diào)控miR?99a 表達(dá)密切相關(guān)。miRNA 作為癌基因或腫瘤抑制因子參與多種類型癌癥的調(diào)控，在癌癥的診斷和治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA 在食管癌中的重要性也引起了越來越多的關(guān)注。然而，大多數(shù)miRNA （包括miR?99a） 在食管癌中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。miR?99a 在多種人類惡性腫瘤中下調(diào)，被報(bào)道為一種潛在的腫瘤抑制因子［21］。資料顯示，ESCC 組織中miR?99a 的表達(dá)較低；過表達(dá)miR?99a 顯著抑制ESCC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial?Mesen?chymal Transition，EMT），并下調(diào)EMT 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基質(zhì)金屬蛋白酶 （Matrix metalloproteases，MMPs），包括MMP2、MMP7 和MMP13，表明ESCC 中miR?99a 的缺失促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［22］。miR?99a 在非小細(xì)胞肺癌組織中下調(diào)，與非小細(xì)胞肺癌患者的晚期和腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；miR?99a 過表達(dá)在體外抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［23］。與正常組織和正常肝細(xì)胞比較，肝癌組織樣品和細(xì)胞中miR?99a 表達(dá)分別顯著降低，Transwell 測(cè)定結(jié)果顯示miR?99a 可抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移［24］。本實(shí)驗(yàn)也有同樣的發(fā)現(xiàn)，即高表達(dá)miR?99a明顯減少Eca109 細(xì)胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，為miR?99a 的抑癌作用提供了新的證據(jù)。同時(shí)，低表達(dá)miR?99a 部分逆轉(zhuǎn)款冬花多糖對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、Cyclin D1、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)的抑制作用，說明款冬花多糖可能通過上調(diào)miR?99a 表達(dá)來發(fā)揮食管癌抑制作用。

PI3K／Akt 通路在多種人類癌癥中被激活，并在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，如ESCC［25］。PI3K／Akt 信號(hào)通路參與食管癌的發(fā)生發(fā)展，抑制其活性可以有效抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［26?28］?？疃ǘ嗵荰FPB1 下調(diào)p?Akt 和Bcl?2 的表達(dá)，上調(diào)caspase?3、Bax 等蛋白的表達(dá)，TFPB1 的抗增殖和抗凋亡作用部分依賴于Akt 信號(hào)通路的抑制［20］。miR?99a 過表達(dá)部分通過抑制PI3K／Akt／mTOR 通路活性誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲的抑制作用和細(xì)胞凋亡［7］。本研究中，款冬花多糖明顯抑制p?PI3K 和p?Akt蛋白表達(dá)，這種抑制作用被低表達(dá)miR?99a 部分逆轉(zhuǎn)，說明PI3K／Akt 信號(hào)通路影響食管癌進(jìn)程，調(diào)控miR?99a 表達(dá)并抑制PI3K／Akt 信號(hào)通路活性可能是款冬花多糖抑制食管癌的重要途徑之一。

總之，目前的結(jié)果證明了款冬花多糖的抗食管癌特性。此外，款冬花多糖顯著增強(qiáng)miR?99a 表達(dá)，并進(jìn)一步抑制／PI3K／Akt 信號(hào)傳導(dǎo)。