白細(xì)胞介素-6啟動子區(qū)rs200852701(G/A)與南通地區(qū)漢族人群膿毒癥發(fā)病關(guān)系的研究

劉亞軍 王智蘭 全超

【摘要】 目的 探討江蘇南通地區(qū)漢族人群中白細(xì)胞介素-6（IL-6）基因3′UTR的rs200852701（G/A）多態(tài)位點單核苷酸多態(tài)性（SNP）與膿毒癥發(fā)病之間的關(guān)系。方法 51例膿毒癥患者作為實驗組， 領(lǐng)選擇52例同期門診行健康體檢患者作為對照組。分別提取實驗組和對照組基因組DNA， 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段并測序。分析IL-6基因啟動子區(qū)rs200852701（G/A）與膿毒癥發(fā)病之間的關(guān)系。結(jié)果 對本實驗的IL-6基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物， 進(jìn)行相關(guān)基因分型， 結(jié)果顯示， 研究對象中IL-6的SNP分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。測序結(jié)果表明IL-6基因存在SNP位點rs200852701（G/A）。實驗組的血漿IL-6水平為（14.23±6.1）pg/ml， 高于對照組的（11.07±3.81）pg/ml， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 IL-6基因3′UTR的靶位點rs200852701（G/A）多態(tài)位點SNP與膿毒癥發(fā)病之間存在一定關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 膿毒癥;白細(xì)胞介素6;單核苷酸多態(tài)性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.20.086

【Abstract】 Objective ? To discuss the correlation between single nucleotide polymorphism （SNP） of interleukin-6 （IL-6） gene 3 'UTR rs200852701 （G/A） and sepsis in Han population in Nantong， Jiangsu province. Methods ? There was 51 sepsis patients as the experimental group， and concurrent 52 healthy examinee as the control group. Genomic DNA was extracted from sepsis group and control group， and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） technology was used to amplify and sequence the target gene. The correlation between IL-6 gene promoter rs200852701 （G/A） and sepsis was analyzed. Results ? The IL-6 gene polymerase chain reaction （PCR） product of this experiment was subjected to related genotyping. The results showed that the distribution of SNP of IL-6 in the study subjects was in line with Hardy-Weinberg genetic balance. Sequencing results showed that there was a SNP site rs200852701 （G/A） in the IL-6 gene. The plasma IL-6 of the experimental group was （14.23±6.1） pg/ml， which was higher than that of the control group （11.07±3.81） pg/ml， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ? IL-6 gene 3′UTR rs200852701 （G/A） polymorphism site is associated with sepsis.

【Key words】 Sepsis; Interleukin-6; Single nucleotide polymorphism

膿毒癥是因感染導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)， 可以導(dǎo)致多器官功能衰竭和死亡。也是目前醫(yī)院患者死亡率和醫(yī)療資源消耗的主要嚴(yán)重疾病之一。在美國， 嚴(yán)重膿毒癥占重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）患者發(fā)病率的10.00%， 致死率可高達(dá)50.00%[1]。而德國2013年有280000例住院患者被診斷為膿毒癥， 其中7500例患者死亡[2]。近年來， 控制膿毒癥的發(fā)病率和死亡率一直是各國重點研究的領(lǐng)域之一。隨著認(rèn)識的深入， 目前膿毒癥的發(fā)病率和死亡率較以往都有了一定程度下降[3]。IL-6是參與系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的促炎細(xì)胞因子之一。先天性和獲得性免疫反應(yīng)中起著重要作用。它促進(jìn)炎癥現(xiàn)象， 比如刺激淋巴細(xì)胞的增殖， 促進(jìn)B細(xì)胞的分化， 是一種最重要的炎癥急性期的反應(yīng)介質(zhì)[4]。IL-6由多種類型的免疫細(xì)胞產(chǎn)生， 包括激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。據(jù)報道[5]， IL-6的基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)病與預(yù)后密切相關(guān)， 國外研究表明[6]IL-6的基因多態(tài)性對預(yù)測燒傷患者的重癥感染發(fā)病率， 膿毒癥患者的預(yù)后有著重要作用。目前， 國內(nèi)對于膿毒癥與基因多態(tài)性相關(guān)文獻(xiàn)報道較為匱乏。單核苷酸多態(tài)性多探索是評估和鑒定某種疾病遺傳傾向的關(guān)鍵方法， 本研究采取經(jīng)典聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性的分析方法， 分析南通地區(qū)漢族膿毒癥患病人群中IL-6基因rs200852701（A/G）多態(tài)性的分布， 并分析其與疾病預(yù)后程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2017年3月～2019年3月入住南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院（南通市中醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科的51例膿毒癥患者作為實驗組， 其中男26例， 女25例;平均年齡（55.53±16.23）歲;肺部感染所致膿毒癥30例， 腹部感染所致膿毒癥17例， 尿路感染所致膿毒癥4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn);②符合2012年國際膿毒癥制定診斷標(biāo)準(zhǔn)及最新sepsis3.0的診斷標(biāo)準(zhǔn);③年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18歲或>80歲;②無或不愿接受中心靜脈置管的患者， 或有置管禁忌患者;③行急診手術(shù)患者;④心臟停搏患者。領(lǐng)選擇52例同期門診行健康體檢患者作為對照組， 其中男31例， 女21例;年齡（54.11±6.06）歲;納入標(biāo)準(zhǔn)：全部對照組人群臨床及實驗室檢查指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)， 排除相關(guān)患有腎病、肝病、內(nèi)分泌系統(tǒng)和心腦血管疾病者。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。本實驗研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)， 所參與對象及其家屬均已對本研究內(nèi)容及目的知情予以充分告知， 并表示自愿參與。

1. 2 方法

1. 2. 1 外周血DNA的提取方法 全部采用離心柱[BloodgenomicDNA Minikit（0.1～1.0 ml）]提取所入選受試對象的外周靜脈血DNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計數(shù)儀器進(jìn)行OD值的檢測， 方法：1.25%瓊脂。電泳緩沖液（0.5XTBE）SYBREGold染色液6X凝脂載樣緩沖液糖凝膠電泳檢測， DNA均質(zhì)檢合格， 轉(zhuǎn)移至96孔板， -20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 引物的設(shè)計與合成根據(jù)SNP位點序列信息 使用Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design設(shè)計PCR和單堿基擴(kuò)展引物， 并交由上海生工公司合成。上游引物：5'-AGATGCAATAACCACCCCTG-3， 下游引物：5'-GATCTGGCTCTGAAACAAAGG-3'。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)體系 4 μl PCR master mix， 1 μl模板DNA（20 ng/μl）。PCR循環(huán)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性20 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min，?重復(fù)45個循環(huán);72℃延伸3 min， 產(chǎn)物4℃冰箱保存， 備用。PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工公司測序， 測序結(jié)果使用Sequercher進(jìn)行基因分析。

1. 3 兩組血漿IL-6檢測 實驗組入院24 h內(nèi)使用采血管收集5 ml外周靜脈血， 對照組使用同品牌采血管收集清晨空腹外周靜脈血5 ml。等待自然凝固后， 放入離心機(jī)（型號Sorvall? Legend? Micro 17）， 離心結(jié)束后取上清， 至-70℃冰箱（海爾DW-50W255）保存， 備用。采用ELISA（AbcamSimpleStep試劑盒）法檢測兩組IL-6，?全部相關(guān)操作均嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)使用說明書步驟進(jìn)行。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。HaploView4.0軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗， 兩組間的基因型及等位基因型頻率比較采用χ2檢驗或按照Fishers確切概率法， 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用方差分析檢驗計量資料的顯著性， 方差不齊時采用對數(shù)轉(zhuǎn)換或采用非參數(shù)的秩和檢驗。95%的可信區(qū)間（95%CI）和比值比（OR）表示相對風(fēng)險度， 用于分析膿毒癥的發(fā)病風(fēng)險。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 當(dāng)患者外周血提取的基因組DNA的濃度跨度為326～460 ng/ml時， 實驗組與對照組的360/480值均在1.8左右， 表明提取的基因組DNA的質(zhì)量相對可靠， 可考慮用于本次實驗所需PCR擴(kuò)增。圖1顯示IL-6第5個外顯子的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。產(chǎn)物大小為390 bp， 與設(shè)計引物對應(yīng)的IL-6基因相同。沒有觀察到明顯的非特異性條帶， 這與理論預(yù)測一致。

2. 2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 對來自103例研究對象的DNA樣品進(jìn)行正向和反向測序后所獲得的測序結(jié)果， 測序成功率在99%以上。見圖2。兩組外周血IL-6基因rs867186（G/A）位點基因型和等位基因的結(jié)果見表1。

2. 3 測序結(jié)果的比較 將本次測序結(jié)果與美國國家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中獲得的IL-6基因的序列進(jìn)行對比， IL-6基因的PCR產(chǎn)物與美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）中查詢所獲得的IL-6序列， 測序結(jié)果是幾乎是相同的， 序列同源性可達(dá)99.5%。見圖3。

2. 4 IL-6基因的SNP分析結(jié)果 對本實驗的IL-6基因PCR產(chǎn)物， 進(jìn)行相關(guān)基因分型， 并予Hardy-Weinberg遺傳平衡試驗以評估群體代表性。結(jié)果顯示， 研究對象中IL-6的SNP分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。測序結(jié)果表明IL-6基因存在SNP位點rs200852701（G/A）。見圖3。

2. 5 兩組血漿IL-6水平比較 實驗組的血漿IL-6水平為（14.23±6.1）pg/ml， 高于對照組的（11.07±3.81）pg/ml，?差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

3 討論

膿毒癥給社會及醫(yī)療帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前研究表明， 膿毒癥是感染為誘因， 從而引起的機(jī)體失控的炎癥反應(yīng)所致， 其反應(yīng)與個體基因表現(xiàn)型有一定的相關(guān)性[7]， 目前， 基因多態(tài)性與感染及膿毒癥的關(guān)系正成為臨床工作者關(guān)注的方向目標(biāo)。

既往眾多相關(guān)研究表明， IL-6的基因多態(tài)性與感染、消化系統(tǒng)疾病、急性呼吸衰竭等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性[8]。目前研究主要關(guān)注于IL-6的多態(tài)性與膿毒癥感染和丙型肝炎的關(guān)系， 已報道的IL-6的SNP位點包括（-174 G>C， -572 G>C和-597 G>A）[9-11]。在一項意大利的研究中發(fā)現(xiàn)[12]， IL-6啟動子端的-597與-174SNP位點在慢性丙肝患者和健康人群中存在顯著差異。在一項關(guān)于膿毒癥的研究中， IL-6的啟動子的-174SNP， 野生型G等位基因具有更低的器官衰竭可能性。也有研究表明[13]， 在1227例CAP的患者中， 那些攜帶GG基因型的患者具有更低的急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病率。通過嚴(yán)格控制和雙盲試驗， 本研究發(fā)現(xiàn)， IL-6多態(tài)性rs200852701與南通地區(qū)漢族人群的膿毒癥發(fā)病率相關(guān)。提示IL-6多態(tài)性rs200852701是膿毒癥的遺傳易感性所存在的相關(guān)因素。本研究結(jié)果亦表明， 實驗組rs200852701位點AA基因型頻率高于對照組， 提示AA基因型提高膿毒癥的發(fā)病率。

本研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥患者中， IL-6的水平顯著增高， 本次實驗發(fā)現(xiàn)IL-6 rs200852701（G>A）上存在新的SNP位點影響IL-6在膿毒癥患者中的表達(dá)， 故推斷IL-6轉(zhuǎn)錄因子基因多態(tài)性rs200852701與南通地區(qū)漢族人群的膿毒癥發(fā)病率相關(guān)。綜合實驗數(shù)據(jù)， 本次實驗所發(fā)現(xiàn)的IL-6基因的多態(tài)性可能是膿毒癥的一種新的遺傳易感性因素。

本研究仍然存在一定的相關(guān)局限性。首先， 由于時間限制， 本次研究收集南通地區(qū)漢族人群膿毒癥患者數(shù)較少， 僅為103例。故進(jìn)一步的研究考慮需要擴(kuò)大時間跨度， 收集更大的隊列和相關(guān)隨機(jī)對象， 應(yīng)考慮進(jìn)行多中心雙盲研究， 以便進(jìn)一步探究rs200852701位點多態(tài)性與膿毒癥之間存在的相關(guān)性及影響機(jī)制， 其次， 由于本次實驗規(guī)模較小， 未能夠比較不同感染部位導(dǎo)致的膿毒癥。增加各部位不同感染類型、完善細(xì)菌培養(yǎng)的相關(guān)檢查數(shù)據(jù)可能會為進(jìn)一步研究關(guān)于IL-6多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展所存在的關(guān)系提供有力證據(jù)。

綜上所述， 本研究結(jié)果表明IL-6多態(tài)性rs200852701與膿毒癥有一定相關(guān)性。仍需深入探討兩者之間的關(guān)系及影響機(jī)制， 從而可能會對膿毒癥的早期發(fā)現(xiàn)、治療提供更好的治療方案， 提高膿毒癥患者的預(yù)后及改善今后的生活質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1] Rubulotta FM， Ramsay G， Parker MM， et al. An international survey： Public awareness and perception of sepsis. Crit Care Med， 2009， 37（1）：167-170.

[2] Eitze S， Fleischmann-Struzek C， Betsch C， et al. Determinants of sepsis knowledge： a representative survey of the elderly population in Germany. Crit Care， 2018， 22（1）：273.

[3] Fernando SM， Rochwerg B， Seely AJE. Clinical implications of the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock （Sepsis-3）. CMAJ， 2018， 190（36）：1058-1059.

[4] Bennermo M， Held C， Stemme S， et al. Genetic predisposition of the interleukin-6 response to inflammation： implications for a variety of major diseases？ Clin Chem， 2004， 50（11）：2136-2140.

[5] Feng M， Sun T， Zhao Y， et al. Detection of Serum Interleukin-6/10/18 Levels in Sepsis and Its Clinical Significance. J Clin Lab Anal， 2016， 30（6）：1037-1043.

[6] Accardo PA， Forte GI， Pileri D， et al. Analysis of IL-6， IL-10 and IL-17 genetic polymorphisms as risk factors for sepsis development in burned patients. Burns， 2012， 38（2）：208-213.

[7] Scicluna BP， van Vught LA， Zwinderman AH， et al. Classification of patients with sepsis according to blood genomic endotype： a prospective cohort study. Lancet Respir Med， 2017， 5（10）：816-826.

[8] Limaye AP， Stapleton RD， Peng L， et al. Effect of Ganciclovir on IL-6 Levels Among Cytomegalovirus-SeropositiveAdults With Critical Illness： A Randomized Clinical Trial. JAMA， 2017， 318（8）：731-740.

[9] Chen Y， Hu Y， Song Z. The association between interleukin-6 gene -174G/C single nucleotide polymorphism and sepsis： an updated meta-analysis with trial sequential analysis. BMC Med Genet， 2019， 20（1）：35.

[10] Lorente L， Martín MM， Pérez-Cejas A， et al. Association between Interleukin-6 Promoter Polymorphism （-174 G/C）， Serum Interleukin-6 Levels and Mortality in Severe Septic Patients. Int J Mol Sci， 2016， 17（11）：1861.

[11] Sharma A， Singh K， Biswas A， et al. Impact of interleukin 6 promoter polymorphisms （-174 G > C， -572 G > C and-597 G > A） on plasma IL-6 levels and their influence on the development of DVT： a study from India. Hematology， 2018， 23（10）：833-838.

[12] Cussigh A， Falleti E， Fabris C， et al. Interleukin 6 promoter polymorphisms influence the outcome of chronichepatitis C. Immunogenetics， 2011， 63（1）：33-41.

[13] Martín-Loeches I， Solé-Violán J， Rodríguez de Castro F， et al. Variants at the promoter of the interleukin-6 gene are associated with severity and outcome of pneumococcal community-acquired pneumonia. intensive care medicine， 2012， 38（2）：256-262.

[收稿日期：2020-03-19]