轉(zhuǎn)錄水平分析轉(zhuǎn)速對克拉維酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響機(jī)制

宋道平 康妮 張佩佩 宗工理 王世立 張堃鈺 曹廣祥 付加芳

（1. 濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250022；2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250062）

克拉維酸（Clavulanic acid，CA）是一種氧青霉烷類廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，為治療β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥菌感染的臨床藥物。CA由棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavuligerus）發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵條件優(yōu)化是提高CA產(chǎn)量的有效手段之一［1-3］。

克拉維酸的生物合成途徑已經(jīng)基本闡明。同位素喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)3-磷酸甘油醛（G3P）和精氨酸是克拉維酸生物合成的前體物質(zhì)［3-4］，然后經(jīng)過六步催化反應(yīng)合成關(guān)鍵中間產(chǎn)物-克拉維胺酸［5］，克拉維胺酸是CA和5S克拉維烷合成代謝的分支點(diǎn)，在此后的反應(yīng)中部分克拉維胺酸在克拉維酸合成晚期基因如cad、cyp450和oppA1等作用下合成克拉維酸［6-7］，另一部分則通過5S分支途徑形成克拉維烷-2-羧酸、丙氨?？死S烷和2-羥甲基克拉維烷等多種5S克拉維烷產(chǎn)物［8-10］。多株S. clavuligerus的基因組已經(jīng)完成測序［11-14］，研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因簇與克拉維酸生物合成有關(guān)，分別為克拉維酸基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇?？死S酸基因簇包含克拉維酸生物合成途徑多數(shù)合成酶的基因，比如ceaS2、bls2、pah2、cas2、oat2、gcas、car、cyp和fd等，位于頭霉素C合成基因簇的下游；克拉維烷基因簇包含克拉維酸合成酶基因cas1和5S分支途徑的合成基因；旁系同源基因簇位于內(nèi)生質(zhì)粒pSCL4，包含多個(gè)同源基因比如ceas1、bls1、pah1和oat1［14］。此外，CA合成受到復(fù)雜的調(diào)控作用，ClaR和CcaR是CA合成的途徑特異性調(diào)控因子［15-16］，而雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CagRS可以同時(shí)調(diào)控CA和CA前體物質(zhì)的合成基因［17］，此外，研究還顯示γ-丁內(nèi)酯信號系統(tǒng)［18］、上游調(diào)控因子 BldG［19］、δ-因子Orf21［20］、氨基酸匱乏［21］都影響 CA 的合成。

S. clavuligerusF613-1是CA的工業(yè)生產(chǎn)菌株，來源于標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27064的長期育種篩選。工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明發(fā)酵過程中提高攪拌轉(zhuǎn)速能夠提高F613-1菌株的克拉維酸產(chǎn)量和縮短發(fā)酵周期，推測可能與高轉(zhuǎn)速能提高發(fā)酵液溶氧水平和傳質(zhì)效果有關(guān)，但并不清楚其具體的分子機(jī)制。因此，本研究擬通過轉(zhuǎn)錄組測序比較分析在高轉(zhuǎn)速發(fā)酵和低轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下F613-1菌株轉(zhuǎn)錄組差異，分析CA合成相關(guān)基因簇、前體物質(zhì)G3P和精氨酸代謝相關(guān)基因的變化情況，以期從轉(zhuǎn)錄水平闡明高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件影響CA合成的分子機(jī)制，為進(jìn)一步通過基因工程方法提高CA產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 棒狀鏈霉菌S. clavuligerusF613-1。

1.1.2 培養(yǎng)條件 F613-1孢子的收集采用BSCA固體培養(yǎng)基（麥芽提取物1.5%，胰蛋白胨0.3%，葡萄糖0.4%，瓊脂粉2%，pH7.5），25oC培養(yǎng)10 d 收集孢子。CA液體發(fā)酵培養(yǎng)：按106個(gè)/mL的接種量將孢子接種于SCZ培養(yǎng)基（大豆超細(xì)粉2%，玉米淀粉1.2%，酵母自溶物0.5%，磷酸氫二鉀0.08%，甘油酸三油酯 1.1%（V/V），pH 7.1）中，25℃、250 r/min培養(yǎng)48 h得到種子液，然后按5%接種量轉(zhuǎn)接至SCF發(fā)酵培養(yǎng)基（大豆超細(xì)粉2.7%，大豆蛋白提取物2.2%，麥芽糊精3.0%，氯化鉀0.15%，六水氯化鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，二水氯化鈣0.04%，六水三氯化鐵0.008%，氯化鋅0.001%，氯化鈉0.018%，MOPS 4.2%，甘油酸三油酯1.6%（V/V），pH 7.1），25℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別設(shè)為200 r/min和300 r/min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液總糖含量和還原糖含量的測定 液體發(fā)酵過程中分別在發(fā)酵0、24、48、72、96、120和144 h取1 mL發(fā)酵液測定發(fā)酵液中總糖和還原糖濃度，檢測方法參照前期研究進(jìn)行［22］。

1.2.2 胞內(nèi)精氨酸含量的測定 分別在發(fā)酵24、48、72、96、120和144 h取1 mL發(fā)酵液，離心收集菌體，測量菌體濕重，然后按照精氨酸（Arg）檢測試劑盒（上海紀(jì)寧，96T）測定胞內(nèi)游離精氨酸的含量。

1.2.3 發(fā)酵液CA含量的HPLC檢測 取1.2.1中發(fā)酵液，離心取上清液后用0.22 μm 濾膜過濾，參照前期研究采用HPLC測定CA含量［22］。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序與分析 收集1.2.1中發(fā)酵72 h的發(fā)酵液，采用TRIzol（Ambion）抽提法提取鏈霉菌F613-1總RNA，質(zhì)檢合格后去除核糖體RNA 并進(jìn)行片段化處理，逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，再合成雙鏈cDNA并純化，接著末端修復(fù)并加接頭引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化，采用illuminaHiseq2500 測序平臺和PE150測序方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序（銳博生物）。原始測序數(shù)據(jù)首先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量分析，然后用參考基 因S. clavuligerusATCC27064（NZ_CM001015.1-NZ_CM001019.1）進(jìn)行比對。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用tbtools軟件進(jìn)行火山圖制作，采用Prism8進(jìn)行數(shù)量差異分析。通過差異倍數(shù)（|log2FoldChange|>1）和顯著水平（q-value<0.001）兩個(gè)水平判斷樣本間差異表達(dá)的基因。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)速條件下CA產(chǎn)量的比較

每隔24 h收集不同轉(zhuǎn)速條件下的發(fā)酵液，分別進(jìn)行CA含量、總糖含量和還原糖含量的測定。結(jié)果顯示在高轉(zhuǎn)速（300 r/min）條件下CA產(chǎn)量顯著高于低轉(zhuǎn)速（200 r/min）條件，其中在48、72和96 h時(shí)CA產(chǎn)量的提高趨勢最顯著，分別達(dá)到0.67、2.15和3.08 g/L，比低轉(zhuǎn)速條件提高了約2.23倍、2.44倍和1.32倍，而在發(fā)酵后期（120 h和144 h）CA產(chǎn)量的提高幅度降低，分別約為1.19倍和1.16倍（圖1-A）。高轉(zhuǎn)速條件下F613-1對總糖的消耗速度也顯著高于低轉(zhuǎn)速條件（圖1-B），說明高轉(zhuǎn)速條件下F613-1對糖的消耗更大，代謝水平更加旺盛。發(fā)酵過程中還原糖總體趨勢為先升高后降低，而高轉(zhuǎn)速發(fā)酵液在48 h和72 h時(shí)還原糖含量的升高幅度顯著高于低轉(zhuǎn)速發(fā)酵液，隨后還原糖含量快速下降（圖1-B），與高轉(zhuǎn)速發(fā)酵液中CA合成速度的趨勢一致，表明高轉(zhuǎn)速條件下高水平還原糖可能與CA合成速度增加有關(guān)，而且高轉(zhuǎn)速條件能夠縮短發(fā)酵周期。研究顯示糖代謝中間產(chǎn)物3-磷酸甘油醛是克拉維酸合成的前體物質(zhì)［1，3，23］，因此，高轉(zhuǎn)速條件下旺盛的糖代謝水平可能是其高產(chǎn)CA的原因之一。

2.2 高轉(zhuǎn)速發(fā)酵和低轉(zhuǎn)速發(fā)酵的整體轉(zhuǎn)錄水平比較

本研究收集了高轉(zhuǎn)速和低轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下第72小時(shí)（CA合成高峰期）的菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量篩選，高轉(zhuǎn)速樣品平均獲得16 721 348 個(gè)有效mRNA 信息，基因覆蓋率為97.04%，低轉(zhuǎn)速樣品平均獲得16 154 651個(gè)有效mRNA 信息，基因覆蓋率為96.84%。通過tbtools軟件進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析并繪制樣本間基因差異火山圖（圖2），結(jié)果顯示高轉(zhuǎn)速樣品和低轉(zhuǎn)速樣品的轉(zhuǎn)錄水平之間存在統(tǒng)計(jì)意義上的顯著差異。與低轉(zhuǎn)速樣品相比較，高轉(zhuǎn)速樣品共有789個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)顯著變化，其中419個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，370個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，說明發(fā)酵轉(zhuǎn)速在整體上顯著影響F613-1菌株的基因轉(zhuǎn)錄水平。

圖1 不同轉(zhuǎn)速條件下克拉維酸產(chǎn)量比較分析

2.3 CA生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄水平變化

S. clavuligerusF613-1中與克拉維酸合成相關(guān)的基因簇共有3個(gè)：克拉維酸基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，結(jié)果顯示與低轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比較，在高轉(zhuǎn)速條件下F613-1中CA合成相關(guān)3個(gè)基因簇中的大部分基因表達(dá)量無明顯變化（表1）。調(diào)控CA合成的調(diào)節(jié)基因claR，cagR和brp的表達(dá)量增加了1-1.5倍，而CA的途徑特異性正調(diào)控基因ccaR的表達(dá)量增加了2.19倍。

圖2 不同樣本間基因差異分析火山圖

表1 不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速下CA合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)差異比較

2.4 CA合成前體精氨酸和G3P代謝途徑基因的表達(dá)變化

精氨酸和3-磷酸甘油醛（G3P）是CA生物合成途徑的2個(gè)起始物質(zhì)。差異分析顯示，與低轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比較，在高轉(zhuǎn)速條件下F613-1中精氨酸生物合成基因簇中所有基因（argH，argG，argR，argD，argB，argJ，argC）表達(dá)量整體上調(diào)大約1-2倍（表2）。本研究進(jìn)一步分析了F613-1菌株在發(fā)酵不同時(shí)間段胞內(nèi)精氨酸的含量，數(shù)據(jù)顯示在高轉(zhuǎn)速條件下F613-1胞內(nèi)的精氨酸含量明顯增加（圖3），與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，說明F613-1在高轉(zhuǎn)速條件下可以積累更多的精氨酸，進(jìn)而促進(jìn)CA的合成。

表2 不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速下精氨酸合成基因的表達(dá)差異比較

圖3 不同轉(zhuǎn)速條件下F613-1菌株胞內(nèi)精氨酸含量比較分析

G3P 既是CA生物合成途徑的直接前體物質(zhì)，同時(shí)也是糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑的重要中間產(chǎn)物。差異分析顯示，與低轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相比較，在高轉(zhuǎn)速條件下F613-1中甘油轉(zhuǎn)化途徑中3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因（SCN_RS26820）表達(dá)量上調(diào)3.55倍（圖4），加速了甘油代謝，有利于G3P的合成。糖酵解（Glycolysis）途徑中多個(gè)酶的編碼基因表達(dá)量下調(diào)（圖4-A），從轉(zhuǎn)錄水平看，盡管通過糖酵解途徑產(chǎn)生的G3P和乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）下降，但通過甘油酸三油酯（Glycerol trioleate）代謝途徑產(chǎn)生的G3P和Acetyl-CoA卻增加。另外，三羧酸循環(huán)（TCA）途徑中多個(gè)基因的表達(dá)量也不同程度的增加（圖4-C），有利于增強(qiáng)TCA過程。精氨酸是CA生物合成途徑的另一個(gè)前體物質(zhì)，從轉(zhuǎn)錄水平看，在高轉(zhuǎn)速條件下F613-1中精氨酸生物合成基因簇中所有基因（argB，argC，argD，argJ，argG，argH）表達(dá)量整體上調(diào)大約1-2倍（圖4-B），有利于增強(qiáng)精氨酸的合成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和總糖含量測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究繪制了低轉(zhuǎn)速和高轉(zhuǎn)速兩種發(fā)酵條件下F613-1菌株的代謝通路變化（圖4）。結(jié)果顯示CA的合成能力與能量代謝正相關(guān)，與低轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件相比，F(xiàn)613-1菌株在高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下甘油轉(zhuǎn)化產(chǎn)生G3P過程、TCA過程和精氨酸合成途徑都有所提高，因此初級代謝途徑的改變可能是CA合成能力增強(qiáng)的原因之一。

圖4 F613-1菌株在不同轉(zhuǎn)速條件下代謝途徑變化情況

3 討論

S. clavuligerusF613-1是發(fā)酵生產(chǎn)克拉維酸的高產(chǎn)菌株，由長期的誘變育種和篩選獲得。與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27064的全基因組比較分析顯示：相比 ATCC27064菌株含有 pSCL1、pSCL2、pSCL3和pSCL4等4個(gè)質(zhì)粒，F(xiàn)613-1只有一個(gè)0.7 Mb的質(zhì)粒，進(jìn)化分析其可能來源于ATCC27064菌株中pSCL2和pSCL4質(zhì)粒的部分序列，因此F613-1菌株相比ATCC27064菌株具有較小的基因組；比較基因組分析發(fā)現(xiàn)F613-1和ATCC27064基因組具有較高的一致性，但F613-1基因組存在一個(gè) RGP（Region of genomic plasticity）區(qū)域；此外，CA基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇的序列比對分析顯示兩個(gè)菌株之間僅在基因間隔區(qū)存在7個(gè)SNP位點(diǎn)。F613-1和ATCC27064的轉(zhuǎn)錄組比較分析顯示［22］：F613-1中CA基因簇和合成基因的轉(zhuǎn)錄水平整體顯著高于ATCC27064菌株，全霉素（另一個(gè)次級代謝產(chǎn)物）合成基因的轉(zhuǎn)錄水平則大幅下調(diào)，與此同時(shí)，精氨酸（CA合成的前體物質(zhì)）的合成基因顯著上調(diào)，提示F613-1菌株高產(chǎn)CA的原因可能與CA基因簇的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)有關(guān)，同時(shí)菌株代謝流向的變化也可能促進(jìn)了CA合成。

發(fā)酵條件優(yōu)化是提高CA產(chǎn)量的有效手段之一［1-3］。本研究進(jìn)一步分析了CA液體發(fā)酵過程中攪拌轉(zhuǎn)速對S. clavuligerus合成CA能力的影響。F613-1菌株在高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下克拉維酸產(chǎn)量顯著提高，可能與高轉(zhuǎn)速能提高發(fā)酵液溶氧水平和傳質(zhì)效果有關(guān)；轉(zhuǎn)錄組測序比較分析發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下，CA合成基因簇中基因表達(dá)量變化雖不顯著，但CA合成途徑的調(diào)控基因ccaR表達(dá)量顯著增加，CcaR可能通過間接調(diào)控初級代謝進(jìn)而影響了CA的合成；此外，轉(zhuǎn)錄組分析顯示F613-1菌株在高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下，整個(gè)精氨酸合成基因簇中基因上調(diào)表達(dá)，因此本研究中F613-1精氨酸合成基因的上調(diào)可能會(huì)促進(jìn)CA的合成。G3P是CA合成的另一個(gè)直接前體物質(zhì)，總糖含量測定和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)613-1菌株在高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件下甘油代謝轉(zhuǎn)化為G3P過程、TCA過程明顯提高，這可能是F613-1在高轉(zhuǎn)速條件下CA產(chǎn)量提高的一個(gè)主要原因。

4 結(jié)論

發(fā)酵轉(zhuǎn)速顯著影響F613-1合成CA的速度，高轉(zhuǎn)速條件下CA合成速度加快并且CA產(chǎn)量提高。轉(zhuǎn)錄組測序顯示高轉(zhuǎn)速條件下基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化，涉及CA合成途徑相關(guān)基因及其途徑特異性正調(diào)控基因、精氨酸生物合成基因簇、G3P代謝途徑相關(guān)基因、TCA循環(huán)途徑相關(guān)基因。高轉(zhuǎn)速發(fā)酵條件促進(jìn)精氨酸和G3P的合成可能對CA產(chǎn)量提高起到重要作用。