IL-4協(xié)同雌二醇對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用及其機(jī)制

馮 磊，張韓特，李 響，孟繁平，李 妍

(1．延邊大學(xué)免疫學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林132013)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，按雌二醇受體(estrogen receptor，ER)是否表達(dá)，可將乳腺癌分為激素依賴型(ER陽(yáng)性)和激素非依賴型(ER陰性)，70% 以上乳腺癌為ER陽(yáng)性，雌二醇對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[1]。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)包含血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞成分以及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子及激素等非細(xì)胞類成分[2]。TME中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞偏向Th2分化和M2極化，并分泌白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等細(xì)胞因子[3]。雌二醇參與免疫細(xì)胞分化和免疫功能調(diào)節(jié)，可以促進(jìn)Th2和M2細(xì)胞分化，抑制Th1細(xì)胞分化和M1細(xì)胞極化[4]。目前，雌二醇聯(lián)合IL-4對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制研究較少，雌二醇與IL-4可能在促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同作用，本研究模擬體內(nèi)激素與細(xì)胞因子共同作用的環(huán)境，旨在闡明IL-4和雌二醇對(duì)雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα)和IL-4受體(interleukin-4 receptor,IL-4R)陽(yáng)性小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品保藏中心。胎牛血清購(gòu)自黃巖四季青有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司，IL-4重組蛋白購(gòu)自北京義翹科技有限公司，雌二醇購(gòu)自北京百靈威公司?？剐∈驟rk1、P70S6K、S6蛋白、ERα和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription 6， STAT6)及其磷酸化抗體購(gòu)自美國(guó)SAB公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體和辣根過(guò)樣化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記第二抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、MTT和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白電泳和免疫印跡相關(guān)緩沖液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。Epics XL型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司，2800型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自荷蘭ProXima公司，DP27型顯微鏡數(shù)碼成像系統(tǒng)購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)自液氮中取出凍存的乳腺癌4T1細(xì)胞，復(fù)蘇后采用含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液、5% CO2、飽和濕度和37℃消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.2%乙二胺四乙酸)消化細(xì)胞后傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率體外培養(yǎng)乳腺癌4T1細(xì)胞，加入不同濃度IL-4(0、12.5、25.0、50.0和100.0 μg·L-1)或雌二醇(0、6.25、12.50、25.00、50.00 nmol·L-1)，作用72 h后MTT比色法檢測(cè)不同濃度IL-4和雌二醇作用后乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率；檢測(cè)前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1),培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜溶解細(xì)胞中還原產(chǎn)物甲臜，按不同處理因素分為對(duì)照組(不進(jìn)行任何處理)、IL-4 組(加入50 μg·L-1IL-4)，雌二醇組(加入12.5 nmol·L-1雌二醇)和聯(lián)合組(加入50 μg·L-1IL-4+12.5 nmol·L-1雌二醇),檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm處各組吸光度(A)值，以A值代表乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期乳腺癌4T1細(xì)胞百分比收集不同因素處理后的細(xì)胞，PBS洗滌2次，采用80%冷甲醇固定細(xì)胞，置于-20℃冰箱中保存。檢測(cè)分析前，將細(xì)胞懸液離心后棄上清，采用PBS洗滌2次，采用400 μL染色液(含PI和RNA酶)懸浮細(xì)胞，室溫染色30 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期乳腺癌4T1細(xì)胞百分比。各周期細(xì)胞百分比=各周期細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Western blotting法檢測(cè)各組乳腺癌4T1細(xì)胞中STAT6、p-STAT6、ERα、Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞，以PBS洗滌2次；末次離心棄上清，加入RIPA裂解液，經(jīng)過(guò)超聲破碎制備細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)各組裂解液的蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)整20 g·L-1，加入上樣緩沖液經(jīng)水浴煮沸5 min，分裝蛋白樣品并冷凍保存，將蛋白樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；轉(zhuǎn)膜電泳將中蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜。采用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉PVDF膜2 h，膜與稀釋的一抗在4℃下反應(yīng)過(guò)夜。次日洗滌PVDF膜3次，將PVDF膜與稀釋的HRP標(biāo)記二抗在室溫下反應(yīng)2 h。洗滌3次后與ECL發(fā)光工作液反應(yīng)2 min，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光照相記錄結(jié)果。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值×100%。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率不同濃度IL-4作用后，與0 μg·L-1IL-4組比較，25.0、50.0和100.0 μg·L-1IL-4組乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)。不同濃度雌二醇作用后，與0 nmol·L-1雌二醇組比較，12.50、25.00、50.00 nmol·L-1雌二醇組乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

*P<0.05 compared with 0 μg·L-1IL-4 group；△P<0.05 compared with 0 nmol·L-1estradiol group.

圖1 IL-4(A)和雌二醇(B)作用后各組乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率

Fig.1 Proliferation rates of breast cancer 4T1 cells after treated with IL-4(A) and estradiol(B) in various groups

與對(duì)照組比較，IL-4 組乳腺癌4T1 細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)；與對(duì)照組比較，雌二醇組乳腺癌4T1 細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)；與 IL-4組或雌二醇組比較，聯(lián)合組乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with IL-4 group;#P<0.05 compared with estradiol group.

圖2 各組乳腺癌4T1細(xì)胞增殖率

Fig.2 Proliferation rates of breast cancer 4T1 cells in various groups

2.2 各組不同細(xì)胞周期乳腺癌4T1細(xì)胞百分比與對(duì)照組比較，IL-4組S期乳腺癌4T1細(xì)胞和G2/M期4T1細(xì)胞百分比升高(P<0.05)；雌二醇組S期4T1細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組比較，IL-4組和雌二醇組G0及G1期細(xì)胞百分比均明顯降低(P<0.05)。與 IL-4組或雌二醇組比較，聯(lián)合組S期和G2/M期4T1細(xì)胞百分比升高(P<0.05)，而G0及G1期4T1細(xì)胞百分比降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3和表1。

2.3 各組乳腺癌4T1細(xì)胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，IL-4組乳腺癌4T1細(xì)胞中ERα蛋白表達(dá)水平升高， 雌二醇組乳腺癌4T1細(xì)胞中 p-STAT6 和ERα蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；聯(lián)合組乳腺癌4T1細(xì)胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖4。

A:Control group;B:IL-4 group; C: Estrogen group;D:Combination group.

表1 各組乳腺癌4T1細(xì)胞的細(xì)胞周期百分比

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with IL-4 group;#P<0.05 compared with estradiol group.

表2 各組乳腺癌4T1細(xì)胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達(dá)水平

*P<0.05 compared with control group.

Lane 1: Control group; Lane 2:IL-4 group; Lane 3:Estradiol group; Lane 4:Combination group.

圖4 各組乳腺癌4T1細(xì)胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of STAT6，p-STAT6， and ERα proteins in breast cancer 4T1 cells in various groups

2.4 各組乳腺癌4T1細(xì)胞中Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，IL-4組乳腺癌4T1細(xì)胞中p-Erk、p-P70S6K和p-S6蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，雌二醇組乳腺癌4T1細(xì)胞中p-Erk、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，聯(lián)合組乳腺癌4T1細(xì)胞中p-Erk、p-P70S6K和p-S6蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3和圖5。

3 討 論

癌細(xì)胞在TME中生長(zhǎng)，不僅包含細(xì)胞成分還包含非細(xì)胞成分，癌細(xì)胞可通過(guò)釋放信號(hào)因子，使相關(guān)免疫細(xì)胞的抑制作用受到限制，從而使癌細(xì)胞獲得免疫逃逸，促進(jìn)其生長(zhǎng)和增殖[5]。T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞在TME中已發(fā)生極化或轉(zhuǎn)化，釋放的細(xì)胞因子(IL-4、IL-10和TGF-β1等)參與和維持TME中免疫細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，釋放的趨化因子可以增強(qiáng)血管新生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[6]。本文作者模擬體內(nèi)TME，研究免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子與腫瘤的相互作用，更好地理解腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

表3 各組乳腺癌4T1細(xì)胞中Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達(dá)水平

Tab.3 Expression levels of Erk，p-Erk，P70S6K，p-P70S6K，S6，p-S6， and GAPDH in breast cancer 4T1 cells in various groups

GroupErkp-ErkP70S6Kp-P70S6KS6 p-S6Control0.325±0.0500.572±0.0690.506±0.0750.496±0.0620.647±0.0650.945±0.112IL-40.354±0.0491.038±0.127*0.523±0.0610.686±0.073*0.682±0.0621.679±0.164*Estrogen0.311±0.0380.964±0.088*0.495±0.0630.701±0.058*0.598±0.083*1.436±0.109*Combination0.362±0.0431.296±0.144*0.488±0.0540.794±0.066*0.697±0.0741.986±0.094*

*P<0.05 compared with control group.

Lane 1: Control group; Lane 2:IL-4 group; Lane 3:Estradiol group; Lane 4:Combination group.

圖5 各組乳腺癌4T1細(xì)胞中Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of Erk，p-Erk，P70S6K，p-P70S6K，S6， and p-S6 proteins in breast cancer 4T1 cells in various groups

IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，生理?xiàng)l件下參與 B細(xì)胞分化、抗體分泌的調(diào)節(jié)，除超敏反應(yīng)和寄生蟲(chóng)感染等情況下IL-4水平升高，多種腫瘤細(xì)胞可分泌IL-4，并表達(dá) IL-4R[7]。體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤不僅受細(xì)胞因子的影響，乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等腫瘤生長(zhǎng)增殖還受雌二醇、孕激素和雄激素等激素的影響[8]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Th2細(xì)胞及其所分泌的IL-4/IL-4R可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2型極化，抗凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。本研究結(jié)果表明：IL-4對(duì) IL-4R陽(yáng)性的小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞增殖有影響，與對(duì)照組比較，IL-4以濃度依賴方式促進(jìn) 4T1細(xì)胞增殖，50 μg·L-1IL-4促進(jìn)作用已較為明顯。小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞表面IL-4R表達(dá)水平較高，IL-4可以結(jié)合癌細(xì)胞表面受體，激活JAK1/STATA6信號(hào)通路，影響腫瘤周圍炎性細(xì)胞的分化和功能，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸，引起腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]；IL-4通過(guò)JAK/STAT6信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化,TEM中巨噬細(xì)胞即腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages，TAMs)為M2極化型[11]。TAM也分泌IL-4和TGF-β等細(xì)胞因子，不僅失去殺傷癌細(xì)胞的能力，而且是腫瘤組織中細(xì)胞發(fā)揮旁分泌效應(yīng)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)淋巴管和血管生成的重要力量[12]。

IL-4/IL-4R可引起AKT、Erk1/2和mTOR激活，mTOR/p70S6K1信號(hào)通路主要參與蛋白質(zhì)合成、葡萄糖代謝、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞凋亡[13]。mTOR上游通過(guò)PI3K/AKT通路或PI3K/AKT/TSC2通路被激活，激活后的mTOR可調(diào)節(jié)P70S6K1活化[14]。本研究結(jié)果顯示：IL-4可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，當(dāng)IL-4濃度為25～50 μg·L-1時(shí)，IL-4以濃度依賴方式促進(jìn)4T1細(xì)胞生長(zhǎng)。IL-4和IL-13(Th2細(xì)胞等分泌)等細(xì)胞因子可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，M2極化高表達(dá)CD206和精氨酸酶 1 (arginase 1, Arg1)，分泌TGF-β、IL-4、IL-10、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)，促進(jìn)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[15]。腫瘤局部Th2細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而M2極化TAMs不僅增加Th2細(xì)胞因子來(lái)源，并可通過(guò)MMP-9和VEGF等促進(jìn)血管和淋巴管重塑；乳腺癌等腫瘤可釋放IL-10和TGF-β，參與TME中Th2細(xì)胞偏移和TAMs向M2極化[16]。除免疫細(xì)胞外，上皮細(xì)胞或乳腺癌等上皮源性腫瘤細(xì)胞也表達(dá)IL-4、IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子受體，Th2和M2極化細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。

ER的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要包括2類，膜受體主要啟動(dòng)ERKs、PI3K/AKT和cAMP /PKA等非基因組模式信號(hào)；核受體主要轉(zhuǎn)導(dǎo)類固醇的基因組作用信號(hào)[18]。按照乳腺癌的分子分型，約70%以上乳腺癌為ER陽(yáng)性，表達(dá)ERα等受體[19]。高表達(dá)ERα的乳腺癌可通過(guò)阻礙雌二醇的產(chǎn)生或者阻止雌二醇和受體結(jié)合而抑制癌細(xì)胞增殖；拮抗雌二醇信號(hào)也可抑制PI3K、AKT和Erk等激酶介導(dǎo)的促進(jìn)細(xì)胞增殖以及抵抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)[20-21]。本研究結(jié)果顯示：當(dāng)雌二醇濃度為12.5～25.0 nmol·L-1時(shí)，雌二醇以濃度依賴方式促進(jìn)4T1細(xì)胞生長(zhǎng)。IL-4和雌二醇協(xié)同作用誘導(dǎo)4T1細(xì)胞后，S期和G2/M期細(xì)胞百分比升高，而G0/G1期細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖率高于對(duì)照組。IL-4和IL-4R也可促進(jìn)PI3K、AKT和Erk激酶信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PI3K和AKT參與p70S6K1磷酸化激活； S6蛋白在p70S6K1等激酶的激活下促進(jìn)細(xì)胞中蛋白翻譯合成的起始環(huán)節(jié)。癌細(xì)胞分裂增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲均伴隨p70S6K1激酶活化和蛋白翻譯過(guò)程增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示：IL-4和雌二醇可協(xié)同作用促進(jìn)ER陽(yáng)性小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞增殖，兩者聯(lián)合作用可使Erk1、p70S6K1和S6蛋白活化相關(guān)位點(diǎn)磷酸化水平升高。本研究結(jié)果顯示：IL-4對(duì)ERα表達(dá)有促進(jìn)作用，而聯(lián)合組乳腺癌4T1細(xì)胞中ERα表達(dá)水平高于IL-4組或雌二醇組。IL-4和雌二醇不僅協(xié)調(diào)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)激酶Erk和P70S6K的磷酸化，也在ER水平具有協(xié)調(diào)作用。

綜上所述，IL-4和雌二醇協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞增殖，協(xié)同效應(yīng)涉及多種機(jī)制。深入研究IL-4和雌二醇協(xié)同作用的分子機(jī)制對(duì)克服腫瘤耐藥、減少癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義。