活化素Ⅰ型受體對小鼠下頜骨髁突軟骨生長發(fā)育的影響及其機(jī)制

閆廣興，葉佳朋，王爽爽，劉蒼維，周怡君，胡 月，郝新青，杜奧博，史 冊，孫宏晨,

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科，吉林 長春 130021；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔病理科，遼寧 沈陽 110001； 4.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科，吉林 長春 130021)

顳下頜關(guān)節(jié)(temporal mandibular joint, TMJ)是僅在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的滑膜關(guān)節(jié)，在張閉口運(yùn)動(dòng)中參與下頜骨的平移和旋轉(zhuǎn)[1]。下頜骨髁突軟骨(mandibular condylar cartilage, MCC)是下頜骨生長和關(guān)節(jié)活動(dòng)的重要部位，但目前有關(guān)MCC形態(tài)和發(fā)生發(fā)展的遺傳、細(xì)胞及分子機(jī)制研究卻依然很少。

小鼠的遺傳學(xué)研究[2-4]表明：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通路參與調(diào)控軟骨的生長發(fā)育。BMP受體由Ⅰ型和Ⅱ型受體組成，其中Ⅰ型受體是特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要決定因素[5-7]。活化素Ⅰ型受體(activin A receptor type Ⅰ, ACVR1)是Ⅰ型BMP受體之一，ACVR1可與多種BMP、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)和活化素配體結(jié)合從而傳導(dǎo)BMP信號通路[8-9]。近年來，ACVR1在生長板軟骨中的作用已逐漸被報(bào)道，小鼠生長板軟骨條件性敲除ACVR1(Col2a1-Cre模型)與同窩野生型小鼠的生長板軟骨細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)比較無明顯異常[10]。由于生長板軟骨與髁突軟骨在胚胎發(fā)生、組織結(jié)構(gòu)和對生長因子反應(yīng)等方面存在一定的差異[11-12]，因此，ACVR1對髁突軟骨生長發(fā)育的作用可能與生長板軟骨不同。ACVR1能抑制小鼠髁突軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)小鼠髁突軟骨細(xì)胞的成軟骨向分化[1, 13- 14]。然而由于體內(nèi)的環(huán)境復(fù)雜多變，尚無文獻(xiàn)報(bào)道ACVR1在MCC發(fā)生發(fā)展中的作用。為了探討ACVR1在MCC發(fā)生發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用條件性ACVR1基因敲除小鼠模型(Osterix-Cre模型)[15]，探討ACVR1在MCC發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制，旨在為臨床上MCC相關(guān)性疾病的病因及治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器基因修飾小鼠來自美國密歇根大學(xué)牙學(xué)院Yuji Mishina實(shí)驗(yàn)室。UltraSensitiveTMSP(兔和鼠)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)，DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，X-gal(型號：B4252)和表面活性劑IGEPAL(型號：I-3021)(美國Sigma公司)，抗Osterix(Osx)抗體(型號：ab209484)、抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體(型號：PC10)、抗Ⅹ型膠原抗體(型號：ab58632)(美國Abcam公司)，甲苯胺藍(lán)染色液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。SZX體式顯微鏡和Vanox倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，micro-CT系統(tǒng)(瑞士Scanco Medical AG公司)。

1.2 模型建立和實(shí)驗(yàn)分組通過小鼠擴(kuò)群和鼠耳鑒定，將基因型為Osterix-Cre; Acvr1+/-的雄性小鼠和基因型為Acvr1fx /fx; RS/RS的雌性小鼠配對，選取雄性子代基因型為Osterix-Cre; Acvr1fx /-; RS/+的小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，Osterix-Cre; Acvr1fx /+; RS/+小鼠作為對照組。于出生當(dāng)天(postnatal day 0, PN0)、出生第21天(postnatal day 21, PN21)和出生第42天(PN42)分別收集標(biāo)本，每組標(biāo)本數(shù)：n≥ 3。

1.3 X-gal染色觀察MCC組織中Osterix-Cre表達(dá)取新生Osterix-Cre; RS/+小鼠，于冷PBS中解剖小鼠并分離小鼠下頜骨，4%多聚甲醛固定10 min，PBS快速?zèng)_洗2次，浸泡液4 ℃浸泡30 min(每10 min換液1次)，X-gal染液37 ℃染色過夜。第2天將下頜骨取出，采用PBS于4 ℃浸泡60 min(每30 min換液1次)，4%多聚甲醛固定20 min，PBS快速?zèng)_洗2次，體式顯微鏡拍照。組織顯現(xiàn)為藍(lán)色的部分為陽性結(jié)果。組織經(jīng)15% EDTA脫鈣，梯度脫水后石蠟包埋，制成3 μm切片。將X-gal染色標(biāo)本制成3 μm切片，常規(guī)脫蠟至水，伊紅Y染色液染色2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 micro-CT法檢測小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度micro-CT檢測方法[16](圖1，見插頁五)：點(diǎn)1為髁突關(guān)節(jié)面的最后點(diǎn)；點(diǎn)2為髁突關(guān)節(jié)面的最前點(diǎn)；點(diǎn)3為髁突最外點(diǎn)；點(diǎn)4為下頜切跡最凹點(diǎn)；點(diǎn)5為下頜升支最凹點(diǎn)。點(diǎn)1和點(diǎn)2連線為髁突寬度，點(diǎn)3至點(diǎn)4和點(diǎn)5連線的垂線為髁頭長度。

1.5 HE和甲苯胺藍(lán)染色觀察MCC細(xì)胞形態(tài)及MCC組織各層軟骨厚度取PN21、PN42實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠，脫頸處死，分離下頜骨，4%多聚甲醛固定，15% EDTA溶液脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成3 μm切片。切片脫蠟至水后，行常規(guī)HE染色，封片后顯微鏡下觀察。甲苯胺藍(lán)染色：切片常規(guī)脫蠟至水后，甲苯胺藍(lán)染液染色60 min，0.2%冰醋酸分化10 s，蒸餾水沖洗，自然風(fēng)干后封片，顯微鏡下觀察MCC細(xì)胞形態(tài)和MCC組織結(jié)構(gòu)[17]。根據(jù)MCC周長將髁突軟骨平均分為三等分(前1/3、中1/3和后1/3)，測量各等分處MCC各層平均厚度。MCC分層(以中1/3區(qū)為例)：關(guān)節(jié)層(articular zone, Ar)、增殖層(proliferative zone, Pr)、成軟骨細(xì)胞層(chondroblastic zone, Ch)和肥大軟骨細(xì)胞層(hypertrophic zone, Hy)。采用Image J和Image-Pro Plus軟件進(jìn)行組織學(xué)測量。

1.6 IHC染色觀察MCC組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和Ⅹ型膠原水平標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PCNA(稀釋比為1∶1 000)和Ⅹ型膠原(稀釋比1∶500)抗體37 ℃水浴鍋孵育2 h，根據(jù)IHC試劑盒說明書滴加生物素標(biāo)記的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素生物素工作液；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。MCC組織中顯現(xiàn)為棕色染色的部分為PCNA和Ⅹ型膠原染色陽性結(jié)果。IHC檢測方法[18]：采用Image-Pro Plus軟件，經(jīng)校準(zhǔn)后測量MCC各層棕色部分的累計(jì)光密度(IOD)值，再除以相對各測量層的面積，作為各層陽性區(qū)域的平均吸光度(A)值,以A值代表MCC中Ⅹ型膠原表達(dá)水平。計(jì)數(shù)各層PCNA陽性細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 X-gal染色觀察MCC組織中Osterix-Cre表達(dá)PN0時(shí)，小鼠MCC形態(tài)與成熟的MCC形態(tài)不同，髁突表面仍存在部分未分化的間充質(zhì)細(xì)胞，此時(shí)髁突軟骨由關(guān)節(jié)表面到關(guān)節(jié)內(nèi)部分層：纖維軟骨細(xì)胞層(fibrous chondrocyte zone，F(xiàn)i)、多態(tài)軟骨細(xì)胞層(polymorphic chondrocyte zone,Pc)、扁平軟骨細(xì)胞層(flattened chondrocyte zone,Fc)和Hy。X-gal染色結(jié)果顯示：新生小鼠的下頜骨染色為藍(lán)色，體式顯微鏡下可見下頜骨、髁和髁突軟骨均被染為藍(lán)色(圖2A，見插頁五)。切片后行伊紅染色結(jié)果顯示：髁突軟骨扁平軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞呈陽性(圖2B，見插頁五),表明Osterix-Cre在髁突軟骨的扁平軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)，間接說明了上述細(xì)胞中ACVR1基因被敲除。為了確定Osterix-Cre在小鼠出生后是否持續(xù)表達(dá)，對PN21的野生型小鼠的髁突軟骨進(jìn)行IHC染色結(jié)果顯示：Osterix-Cre位于髁突軟骨的成軟骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞中(圖2C，見插頁五)，提示ACVR1基因在上述細(xì)胞中持續(xù)缺失。

2.2 PN21時(shí)2組小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度micro-CT檢測結(jié)果顯示：PN21時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠下頜骨中均能觀察到形態(tài)完整的髁突，對髁突寬度和髁頭長度測量及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度均明顯短于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 PN21時(shí)2組小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度

GroupnCondylar widthCondylar head lengthControl81.20±0.052.27±0.42Experiment101.09±0.10*2.25±0.07*

*P<0.05 compared with control group.

2.3 PN21時(shí)2組小鼠MCC細(xì)胞形態(tài)和MCC組織各層軟骨厚度HE染色和甲苯胺藍(lán)染色可見：2組小鼠髁突軟骨結(jié)構(gòu)完整，均能觀察到Ar、Pr、Ch和Hy各層及正常MCC細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)。見圖3(插頁五)。檢測小鼠髁突不同區(qū)域的各層軟骨厚度結(jié)果顯示：髁突前、中和后1/3的各層軟骨厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組小鼠中1/3區(qū)域的Ch與對照組比較出現(xiàn)增厚趨勢，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.06)。見表2。

2.4 PN21時(shí)2組小鼠MCC組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和Ⅹ型膠原表達(dá)水平IHC染色結(jié)果顯示：PCNA主要表達(dá)于增殖期細(xì)胞的細(xì)胞核，陽性細(xì)胞(棕色)主要位于MCC組織中的Pr、Ch和Hy，見圖4(插頁五)。由于Osterix-Cre主要表達(dá)于Ch和Hy，ACVR1在這2層軟骨細(xì)胞中敲除，其最可能影響這2層的增殖和分化。實(shí)驗(yàn)組小鼠MCC組織中單個(gè)Hy以及Ch和Hy兩層中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組小鼠MCC組織中Ch中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)與對照組比較出現(xiàn)增多趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.13)。見表3。

表2 PN21時(shí)2組小鼠MCC組織各層軟骨厚度

GroupnArAnterior partIntermediate partPosterior partControl836.19±13.1830.16±13.7143.07±19.90Experiment1032.92±3.3941.21±13.8753.60±9.89GroupnPrAnterior partIntermediate partPosterior partControl822.61±2.7926.11±7.2631.89±3.57Experiment1027.00±9.8635.42±12.1133.32±12.08GroupnChAnterior partIntermediate partPosterior partControl827.12±11.0827.68±7.8535.53±8.49Experiment1029.58±9.0340.50±9.2738.78±13.58GroupnPrAnterior partIntermediate partPosterior partControl867.91±34.8891.83±29.4999.75±29.55Experiment1065.39±18.9775.99±13.9775.51±23.06

Ⅹ型膠原主要由髁突軟骨的Ch和Hy表達(dá)并分泌。采用Image-Pro Plus軟件測量Ch和Hy中Ⅹ型膠原陽性區(qū)域結(jié)果顯示：在PN21時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠Ch和Hy兩層MCC細(xì)胞中Ⅹ型膠原表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表3 PN21時(shí)2組小鼠MCC組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)

GroupnNumber of PCNA positive cells Ch Hy Ch and HyControl824.25±4.432.75±0.9627.00±3.56Experiment1029.33±2.086.67±1.53**36.00±2.00*

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

2.5 PN42時(shí)2組小鼠MCC組織形態(tài)表現(xiàn)HE和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示：PN42時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠部分髁突軟骨細(xì)胞形態(tài)異常，成軟骨細(xì)胞肥大化進(jìn)程減慢，部分髁突肥大軟骨細(xì)胞的排列紊亂，見圖5(插頁五)。由于髁突軟骨在PN42 Ar變薄，所以將Ar和Pr厚度一起測量；此外，由于髁突軟骨中部為主要咀嚼受力區(qū)域，因此在中部區(qū)域測量Ar、Pr和Ch總厚度結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組小鼠髁突軟骨前1/3區(qū)Hy和中1/3區(qū)Ar、Pr和Ch這3層總厚度均明顯厚于對照組，且前1/3區(qū)Ch厚度較對照組有增厚趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.083)，其他各層厚度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表4 PN21時(shí)2組小鼠MCC組織中Ⅹ型膠原表達(dá)水平

GroupnLevel of type Ⅹcollagen ChHyControl80.16±0.040.15±0.06Experiment100.15±0.060.17±0.06

*P<0.05 compared with control group.

表5 PN42時(shí)2組小鼠MCC組織各層軟骨厚度

GroupnArAnterior partIntermediate partPosterior partControl824.47±5.7271.19±10.0562.63±21.19Experiment1025.19±4.90101.82±12.75**58.25±15.16GroupnPrAnterior partIntermediate partPosterior partControl824.47±5.7271.19±10.0562.63±21.19Experiment1025.19±4.90101.82±12.75**58.25±15.16GroupnChAnterior partIntermediate partPosterior partControl835.36±6.2071.19±10.0557.31±15.50Experiment1050.61±16.05101.82±12.75**56.71±16.82GroupnHyAnterior partIntermediate partPosterior partControl853.66±9.8180.59±19.24110.10±25.73Experiment1077.95±15.81*83.35±17.67108.50±20.67

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

2.6 PN42時(shí)小鼠MCC組織中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)和Ⅹ型膠原表達(dá)水平IHC染色結(jié)果顯示：在PN42時(shí)，PCNA主要表達(dá)于Pr、Ch和Hy。在PN42時(shí)，Ar較薄，且Pr和Ch界限不清，見圖6(插頁五)，實(shí)驗(yàn)組小鼠髁突軟骨中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組。

Ⅹ型膠原主要位于髁突軟骨的Ch和Hy。在PN42時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠髁突軟骨Ch中Ⅹ型膠原表達(dá)水平大于對照組，說明在Ch中Ⅹ型膠原的分泌增多。Hy中Ⅹ型膠原表達(dá)水平與對照組比較無明顯差異。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用條件性ACVR1基因敲除小鼠模型(Osterix-Cre模型)檢測小鼠髁突軟骨的形態(tài)、組織學(xué)結(jié)構(gòu)、髁突軟骨細(xì)胞的增殖和分化結(jié)果顯示：ACVR1通過抑制髁突軟骨細(xì)胞的增殖和成軟骨細(xì)胞向肥大軟骨細(xì)胞的分化，在調(diào)控髁突軟骨的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

本課題組選擇Osterix-Cre是由于Osterix表達(dá)于胚胎期(第13.5天時(shí))髁突軟骨剛形成時(shí)[19]。本課題組采用的基因修飾小鼠攜帶Rosa26報(bào)告基因，即當(dāng)Cre在表達(dá)Osterix的細(xì)胞中被激活后LacZ開始表達(dá)。因此可通過X-gal染色顯示LacZ陽性細(xì)胞，間接說明上述細(xì)胞表達(dá)Osterix。在本實(shí)驗(yàn)中，X-gal和IHC染色結(jié)果也進(jìn)一步明確了PN0和PN21時(shí)，Osterix-Cre主要表達(dá)于Ch和Hy，說明在模型小鼠中，ACVR1在這部分軟骨細(xì)胞中被敲除。

本研究結(jié)果顯示：MCC組織厚度異常出現(xiàn)在PN42時(shí)，而PN21時(shí)2組小鼠MCC組織厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文作者推測：由于在PN21時(shí)，髁突軟骨增殖細(xì)胞數(shù)較少，并未影響髁突軟骨整層組織學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，因此導(dǎo)致雖然實(shí)驗(yàn)組小鼠髁突軟骨增殖細(xì)胞數(shù)增加，但并未引起整層組織結(jié)構(gòu)及厚度的改變。研究[20-21]顯示：咀嚼誘導(dǎo)的機(jī)械應(yīng)力也影響髁突軟骨的生長發(fā)育，由于在出生后21 d小鼠斷奶，開始發(fā)生自我咀嚼，這也可能是造成PN42時(shí)小鼠髁突軟骨厚度發(fā)生變化的原因之一。RIGUEUR等[10]發(fā)現(xiàn)：條件性敲除ACVR1(Col2a1-Cre)的小鼠在胚胎期(第17.5天時(shí))椎體軟骨中軟骨細(xì)胞增殖率降低，這與本研究結(jié)果相反，可能是由于ACVR1在椎體軟骨和髁突軟骨中發(fā)揮了不同的作用，或可能是由于ACVR1在體內(nèi)不同發(fā)育時(shí)期具有不同的作用，或可能是不同的Cre啟動(dòng)子導(dǎo)致了不同的結(jié)果。張琦[22]發(fā)現(xiàn)：沉默ACVR1后小鼠髁突軟骨細(xì)胞的增殖水平升高，這與本研究結(jié)果一致。

Ⅹ型膠原蛋白是軟骨細(xì)胞終末分化的標(biāo)志物，在PN42時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠Ch內(nèi)MCC細(xì)胞中Ⅹ型膠原水平明顯增多，說明隨著出生后小鼠年齡的增長，ACVR1抑制了髁突軟骨Ⅹ型膠原的分泌。Ch中Ⅹ型膠原增多而中后部Hy厚度無改變的可能原因是ACVR1促進(jìn)了Hy中肥大軟骨細(xì)胞的的凋亡從而并未影響Hy的厚度，或者可能由于咀嚼力的在ACVR1缺失小鼠中發(fā)揮了更重要的作用。本課題組前期研究[22]結(jié)果表明：體外培養(yǎng)髁突軟骨細(xì)胞并沉默ACVR1基因后Ⅹ型膠原的分泌水平降低，這與本研究結(jié)果相反，可能原因是體內(nèi)Ⅹ型膠原的調(diào)控機(jī)制較體外更為復(fù)雜，且體外提取細(xì)胞的小鼠為3周齡(體質(zhì)量為10～12 g)，與體內(nèi)觀察到Ⅹ型膠原增多的PN42時(shí)期結(jié)果也不同。

綜上所述，出生后小鼠不斷生長，尤其是斷奶后的發(fā)育時(shí)期ACVR1基因缺失導(dǎo)致了小鼠髁突軟骨不同層的增殖和分化的改變。ACVR1對小鼠髁突軟骨的正常發(fā)育至關(guān)重要。