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    急性白血病免疫表型及陽性細(xì)胞比例分析

    2012-09-11 07:11:30李智山
    檢驗醫(yī)學(xué) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:陽性細(xì)胞亞型白血病

    莫 揚(yáng),李智山

    (襄陽市中心醫(yī)院檢驗科,湖北 襄陽 441021)

    急性白血病(acute leukemia,AL)是由于造血細(xì)胞分化阻滯并克隆性增生所致的惡性疾病,免疫分型不僅可以識別白血病細(xì)胞的系列來源以及所處的分化階段,而且可利用某些抗原表達(dá)及亞型判斷疾病預(yù)后?,F(xiàn)今流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)免疫表型分析已成為AL診斷和分型的重要工具,采用 CD45/側(cè)向角散射(SSC)雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門方法可清楚地識別白血病細(xì)胞克隆,排除了正常細(xì)胞對免疫分型的影響,使得白血病免疫分型結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。流式細(xì)胞術(shù)在白血病免疫分型中用到許多抗體,包括早期非特異性抗體和各系列相關(guān)抗體,而各系列相關(guān)抗體的敏感性及特異性文獻(xiàn)報道不盡一致,尤其是各亞型多種抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例報道極少,現(xiàn)將襄陽市中心醫(yī)院研究結(jié)果報告如下。

    材料和方法

    一、臨床資料

    選取2007年1月至2010年12月在襄陽市中心醫(yī)院初診及外院送檢的AL患者共89例,男48例,女41例,平均年齡36.65(3~66)歲。依據(jù)法國(French)、美國(American)、英國(British)三國協(xié)作組(FAB)制定的分型標(biāo)準(zhǔn)分為:急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)29例[急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)26例,急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)3例],急性髓細(xì)胞白血病(AML)60例(M12例、M234例、M38例、M46例、M510例)。

    二、方法

    1.單克隆抗體選擇原則 選用單克隆抗體熒光標(biāo)記分別為異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)、別藻青蛋白(APC)。依據(jù)敏感性與特異性兼顧的原則,確定B-ALL選用CD19-APC(高敏感性)和cCD79a-PE(高特異性);確定T-ALL選用CD7-FITC(高敏感性)和 cCD3-FITC(高特異性);確定 AML選用CD13-PE(高敏感性)和髓過氧化物酶(cMPO)-FITC(高特異性)。其他抗體還有:CD117-PE、CD33-PE、CD11b-APC、CD14-APC、CD64-FITC、CD56-FITC、CD8-FITC、CD4-APC、CD10-FITC、CD34-PE、CD38-APC、CD3-FITC、CD45-PerCP、主要組織相容性抗原(HLA-DR)-PE及同型對照IgG1-FITC/IgG1-PE。以上熒光標(biāo)記抗體購自美國Becton Dickinson公司。

    2.標(biāo)本采集和流式細(xì)胞術(shù)分析 取肝素鈉抗凝骨髓或外周血2 mL,標(biāo)本中原始幼稚細(xì)胞占全部有核細(xì)胞比例≥20%。采用四色直接標(biāo)記,每管取細(xì)胞數(shù)1×106/mL。胞膜抗原檢測加CD45-PerCP及每種分型單克隆抗體各20 μL,室溫暗處孵育15 min,加入溶血劑溶血10 min,加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后上機(jī)分析;胞內(nèi)抗原檢測首先加CD45-PerCP后暗處孵育15 min,加溶血劑溶血10 min,PBS洗滌后加透膜劑暗處孵育10 min,加入胞內(nèi)抗體室溫暗處孵育20 min,加PBS洗滌后上機(jī)分析。每測定管獲取100000個細(xì)胞。測定結(jié)果采用cellquestpro軟件分析:首先以CD45/SSC設(shè)門,圈定CD45弱陽性和SSC較小區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行分析。然后以其他抗體的二維散點(diǎn)圖結(jié)合細(xì)胞散點(diǎn)分布特點(diǎn)確定白血病細(xì)胞在每種抗體的陽性率。胞內(nèi)抗體以陽性細(xì)胞≥10%為陽性,胞膜抗體以陽性細(xì)胞≥20%為陽性[1]。本研究采用 FACSCalibur(美國 Becton Dickinson公司)流式細(xì)胞儀,測定前以標(biāo)準(zhǔn)校正熒光微球校正儀器;溶血劑及透膜劑均為美國 Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

    三、統(tǒng)計學(xué)方法

    結(jié) 果

    一、AL抗原表達(dá)特征

    B-ALL主要表達(dá)抗原為:cCD79a、CD19、HLA-DR、CD34、CD38、CD13、CD10、CD33;T-ALL主要表達(dá)抗原為:cCD3、CD38、CD7、CD34、HLADR、CD4、CD33、CD8;AML 主要表達(dá)抗原為:cMPO、CD38、CD13、CD33、CD117、HLA-DR,CD14僅在 M4和 M5b表達(dá);M3主要表達(dá)抗原為:cMPO、CD117、CD38、CD13、CD33,低表達(dá) HLADR、CD34。交叉抗原表達(dá):B-ALL主要伴有CD13、CD33表達(dá),T-ALL主要伴有 CD33表達(dá),AML主要伴有 CD7、CD56表達(dá),但 M3除外,見表1。

    二、各亞型陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例

    對各亞型(M1由于病例少未納入分析)抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其平均陽性細(xì)胞比例有區(qū)別。胞漿抗體cMPO、cCD79a、cCD3作為系列特異性標(biāo)志在AML(M5除外)、B-ALL、T-ALL中陽性細(xì)胞均有較高的比例,在 50% ~70% 之間;M2中 CD13、CD33、CD34、HLA-DR、CD38陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例均>60%,說明這些抗原表達(dá)強(qiáng)度高;M3以CD13、CD33陽性細(xì)胞比例高,雖有部分患者表達(dá)CD34、HLA-DR,但其陽性細(xì)胞比例較低,分別僅有31.5%及27.2%,說明抗原為弱表達(dá);M4中以CD38、HLA-DR、CD33陽性細(xì)胞比例高,而 CD13僅為42.6%,與M2有較大區(qū)別;M5中以CD13、CD33、CD34、HLA-DR 抗原強(qiáng)表達(dá),CD13、CD33表達(dá)強(qiáng)度無明顯差異,但cMPO陽性細(xì)胞比例較低,約在 35%左右;B-ALL中以 CD19、CD10、CD34、CD38強(qiáng)表達(dá),屬于交叉抗原表達(dá)的CD13明顯強(qiáng)于CD33的表達(dá)強(qiáng)度;T-ALL中CD7、CD34陽性細(xì)胞比例在80% ~90%,3例患者中有2例出現(xiàn)CD33表達(dá)且陽性細(xì)胞比例高達(dá)80%,見表2。

    表1 FAB各亞型免疫表型特征

    表2 各亞型抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例(,%)

    表2 各亞型抗原陽性表達(dá)患者中陽性細(xì)胞的比例(,%)

    注:與M2同指標(biāo)比較,*P<0.05、**P<0.01;與CD13比較,#P<0.01;—為陰性表達(dá)或病例數(shù)少未納入統(tǒng)計

    抗原M2 M3 M4 M5 B-ALL T-ALL CD7 52.7 ±30.6 — 35.22 ±10.2 — —92.0 ±0.5 CD117 34.8 ±14.7 45.2 ±12.6 20.51 ±4.4 23.3 ±5.9 — —CD38 67.9 ±26.5 48.4 ±20.7 75.9 ±3.8 52.1 ±26.5 72.3 ±19.1 55.9 ±17.9 CD13 73.9 ±21.3 61.6 ±20.3 42.6 ±19.7** 72.8 ±24.0 71.6 ±27.1 —CD34 75.7 ±21.4 31.5 ±10.2 67.9 ±1.5 70.4 ±7.1 73.7 ±21.5 91.1 ±7.5 HLA-DR 66.7 ±24.6 27.2 ±2.1 79.3 ±8.5 60.3 ±23.6 89.4 ±10.0 59.5 ±52.0 CD33 66.8 ±24.2 70.3 ±25.2 80.7 ±16.3* 87.8 ±21.2 45.7 ±22.6# 83.5 ±16.9#cMPO 54.4 ±11.7 63.0 ±16.2 70.4 ±9.5 34.5 ±10.1* — —CD11b 25.9 ±13.7 32.7 ±9.1 35.8 ±7.6 34.6 ±10.3 24.5 ±1.7 —CD64 28.3 ±14.8 40.5 ±10.2 41.2 ±15.8 78.1 ±23.9** — —CD14 — — 34.4 ±3.1 57.3 ±45.4 — —CD10 — — — — 66.7 ±15.4 —CD19 — — — — 67.4 ±23.2 —cCD79a — — — — 69.8 ±22.1 —cCD3— —53.6 ±18.9

    三、系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例

    將AML各亞型合并統(tǒng)計可知,AML中系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例為 CD13(96.7%,68.6% ± 22.7%)、CD33(95.0%,72.6% ± 23.5%)、cMPO(90.0%,57.5% ± 26.9%)、CD117(73.3%,33.7% ±14.4%);B-ALL中系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例為 cCD79a(96.2%,69.8% ± 22.1%)、CD19(96.2%,67.4% ±23.2%)、CD10(53.8%,66.7% ± 15.4%);TALL中系列分化抗原總表達(dá)率及陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例為 cCD3(100.0%,53.6% ±18.9%)、CD7(66.7%,92.0% ±0.5%)。

    討 論

    從本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),胞漿抗原cMPO、cCD79a、cCD3作為系列特異性標(biāo)志在AML、BALL、T-ALL中總的表達(dá)率高達(dá)90%以上,且陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例較高,在50% ~70%之間(M5稍低),是確定系列必須的抗原。cMPO在AML各亞型中表達(dá)率均高,但其陽性表達(dá)細(xì)胞比例在M5僅有34.5%,明顯低于其他AML亞型,在區(qū)別M2與M5時可供參考。本研究3例TALL中有1例僅以cCD3陽性表達(dá),依據(jù)2001年世界衛(wèi)生組織(WHO)AL積分系統(tǒng)[2]評分標(biāo)準(zhǔn),T系積分>2分而診斷。

    AML中 CD13、CD33表達(dá)率均 >95%,是AML的標(biāo)志性抗體,但其陽性表達(dá)患者的陽性細(xì)胞比例有差別,M2中 CD13的陽性細(xì)胞比例(73.9%)明顯高于M4(42.6%),而其CD33 的陽性細(xì)胞比例(66.8%)低于 M4(80.7%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明二者的陽性細(xì)胞比例在鑒別M2與M4時有參考價值。國內(nèi)、外關(guān)于 AML中CD117 表達(dá)率的報道為 58.2% ~90.38%[3-5],本研究為73.3%,但其陽性細(xì)胞比例只在20% ~45%之間,與李慶等[6]結(jié)果相符,顯示CD117在AML中為弱表達(dá)抗原,但未見在ALL中表達(dá),可作為AML的特異性抗原。CD14只在M4/M5b中表達(dá),對單核系統(tǒng)的特異性很高,其陽性細(xì)胞比例分別為 34.4%及 57.3%,與寧鉑濤等[7]的研究結(jié)果一致。CD64在M5中顯示出較高的表達(dá)率和陽性細(xì)胞比例(60.0%,78.1% ± 23.9%),從而有助于區(qū)別 M2(11.8%,28.3% ±14.8%),國外文獻(xiàn)報道CD64對于M4、M5敏感性和特異性均很高[8];M3 中 CD117、CD13、CD33 均 為100.0%表達(dá),陽性細(xì)胞比例分別為 45.2%、61.6% 和70.3%,王亞哲等[9]的文章報道使用PharMingen公司抗體,CD117在M3中陽性細(xì)胞比例為71.97%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究結(jié)果,可能與抗體種類不同有關(guān)。部分M3患者表達(dá)CD34、HLADR,但其陽性細(xì)胞比例僅有31.5%和27.2%,為弱表達(dá)抗原。

    B-ALL中CD19及CD10表達(dá)率和陽性細(xì)胞比例均高,是確定 B系的主要抗原;CD13和CD33是B系交叉表達(dá)的主要抗原,表達(dá)率相似,但CD13的陽性細(xì)胞比例(71.6%)明顯強(qiáng)于CD33(45.7%)。3例T-ALL中有2例表達(dá)CD7,并且陽性細(xì)胞比例高達(dá)92.0%,說明CD7是TALL表達(dá)重要抗原,而在AML中陽性細(xì)胞比例約為30% ~50%,提示當(dāng)CD7陽性細(xì)胞比例明顯升高時更應(yīng)該考慮T-ALL的可能性。這2例患者同時伴有CD33的強(qiáng)表達(dá),陽性細(xì)胞比例83.5%,而CD13為陰性表達(dá),與B-ALL有很大的不同。陳麗娟等[10]報道136例T-ALL中31例帶有髓系標(biāo)記,CD13表達(dá)高于CD33,與本研究結(jié)果不同,可能與我們的病例數(shù)太少有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。胞漿cCD3是T-ALL診斷的特異性和敏感性均較高的指標(biāo),一般在AML和B-ALL中無表達(dá),本組2例T-ALLCD3陰性而胞漿cCD3檢測呈陽性,說明cCD3比CD3敏感性更高。因此,對于伴有其他T系抗原標(biāo)志而CD3陰性患者,應(yīng)常規(guī)檢測cCD3。

    CD34為干/祖細(xì)胞相關(guān)抗原,CD34陽性白血病提示白血病細(xì)胞是早期的造血細(xì)胞惡化所致,在AML中的陽性率達(dá)40% ~60%,和預(yù)后有關(guān)[11]。本研究顯示AML中CD34總的表達(dá)率為55.0% ,ALL中 CD34總表達(dá)率為65.5%,均與文獻(xiàn)報道相符合[12]。除 M3外,CD34陽性細(xì)胞比例均顯示出較高的水平。另一造血系統(tǒng)早期抗原HLA-DR在M3表達(dá)率及陽性細(xì)胞水平均較低,在其他類型AL中均為高表達(dá)。

    綜上所述,AL各亞型間抗原表達(dá)率及陽性細(xì)胞的比例存在差異,可作為流式細(xì)胞術(shù)免疫分型診斷的依據(jù)。

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