RHBDF2基因過表達慢病毒載體的構(gòu)建和穩(wěn)定表達RHBDF2細胞系的建立

陳少鳳，李勝男，鄧 福，朱佩儀，李 友

(1.廣東省衰老相關(guān)心腦疾病重點實驗室，廣東 湛江 524002；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)病學研究所，廣東 湛江 524002)

非活性菱形蛋白酶(inactive rhomboids，iRhoms)最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)[1]，是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號傳導途徑的主要激活因子[2]。哺乳動物主要表達2種菱形蛋白酶[3]：iRhom1和iRhom2。iRhom2也稱為RHBDF2，是菱形絲氨酸蛋白酶家族成員之一，但缺乏蛋白水解活性，其編碼基因定位于1號染色體長臂(17q25.1)，編碼856個氨基酸。

研究[4]顯示：RHBDF2能控制腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(tumor necrosis factor-α-converting enzyme，TACE)激活和運輸，RHBDF2可以結(jié)合TACE并促進其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體，然后轉(zhuǎn)運到細胞表面。TACE亦稱為去整合素-金屬蛋白酶17(ADAM metallopeptidase domain 17，ADAM17)，是一種多結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白分子，能將無活性TNF-α前體(pro-TNF-α)轉(zhuǎn)化成可溶、有活性的可溶性TNF-α(sTNF-α)[5]。TACE底物分子眾多，可通過活化TNF-α[6]、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)、白細胞介素6R(interleukin-6R，IL-6R)、白細胞介素1R(interleukin-1R，IL-1R)、L-選擇素(L-selectin)、C-X3-C基序趨化因子配體1(C-X3-C motif chemokine ligand 1，CX3CL1)[7]、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM1)、血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白(Cadherin in vascular endothelial cells，VE-Cadherin)、內(nèi)皮細胞黏附分子1(endothelial cell adhesion molecule 1，ECAM-1)、血小板內(nèi)皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules，PECAM)和連接黏附分子A(junction adhesion molecule A，JAM-A)[8]等廣泛表達于脈管系統(tǒng)細胞表面的底物蛋白分子而參與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)這一血管炎癥反應(yīng)。在載脂蛋白E缺乏(apolipoprotein E deficiency，ApoE-/-)的AS模型大鼠中可見ADAM17高表達于AS斑塊表面，且血液中sTNF-α和可溶性TNFR(sTNFR)水平隨AS的進展而升高[9]。急性心肌梗死患者的冠狀AS斑塊表面可見TACE表達水平升高，且TACE表達水平與血液游離TNF-α水平呈正相關(guān)關(guān)系；自頸動脈和主動脈斑塊表面分離的巨噬細胞表面亦可見TACE呈高水平表達[10]。

研究[11]表明：RHBDF2在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)刺激的巨噬細胞中表達明顯升高，抑制RHBDF2表達可減輕ox-LDL誘導的巨噬細胞炎癥反應(yīng)。由此本文作者推測：RHBDF2也可能通過調(diào)節(jié)TACE轉(zhuǎn)運，促進TNF-α釋放而參與AS的進程，因而可能成為預防和治療AS的潛在靶點。本研究通過構(gòu)建RHBDF2基因的過表達載體并包裝成慢病毒，感染人臍靜脈細胞融合細胞(EA.hy926細胞)，建立穩(wěn)定表達RHBDF2的細胞，為進一步研究RHBDF2在AS中的功能作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、質(zhì)粒、主要試劑和儀器人胚胎腎HEK293T細胞購于中國科學院上海細胞所，EA.hy926細胞購自美國ATCC公司。慢病毒載體質(zhì)粒pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro購自廣州賽業(yè)公司，輔助包裝質(zhì)粒psPAX2(pHelper1)和pMD2G(pHelper2)購自上海復百澳公司，其中pLV[Exp]-EGFP能表達綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)。大腸桿菌DH5α感受態(tài)(北京索萊寶公司)，NcoⅠ酶和T4 DNA連接酶(美國NEB公司)，10×Annealing Buffer(美國OriGene公司)，質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒(北京TIANGEN公司)。DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、0.05%胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)，Lipofectamine 2000和TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)，2×增強型實時熒光定量PCR預混液(中國GenStar公司)。RHBDF2和GAPDH的PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，Anti-iRhom2抗體(英國Biorbyt公司)，Anti-β-actin抗體(美國Sigma公司)，鼠二抗和兔二抗(美國CST公司)。熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，倒置光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，化學發(fā)光檢測儀(美國Azure公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)HEK293T細胞和EA.hy926細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS和1% 青霉素-鏈霉素)，置于37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度大于90%且生長狀態(tài)良好時用0.05%胰蛋白酶消化傳代，每隔2～3 d傳代1次。

1.3 引物設(shè)計和合成在NCBI上查找目的基因RHBDF2(Gene ID：217344)序列，結(jié)合慢病毒過表達載體pLV [Exp]-EGFP閱讀框克隆位點，根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計并合成1對兩端包含attB序列的引物。RHBDF2上游引物為5′-CCAGATCTATGGCCTCAGCTGACAAGAATG-3′，下游引物為5′-CCCAAGCTTTTAGTGTAGCACCTGGTCTAG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將合成1對兩端包含attB序列的目的基因引物通過PCR擴增后得到DNA片段，PCR反應(yīng)體系(20 μL)：DNA模板1 μL，上游引物(5 μmol·L-1)2 μL，下游引物(5 μmol·L-1) 2 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，10×緩沖液2 μL，Taq酶0.15 μL，加入ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃變性3 min；35個循環(huán)(95℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1 min)；72℃繼續(xù)延伸5 min，4℃保存。擴增得到的DNA片段(含attB位點)和包含attP位點的供載體(pDONR Vector)在BP酶的作用下，發(fā)生BP反應(yīng)得到入門克隆(Entry Clone)，通過菌落PCR，測序篩選出正確的Entry Clone；然后將測序正確的Entry Clone質(zhì)粒DNA(含attL位點)與目的載體(含attR位點)進行LR重組反應(yīng)，同時將啟動子EF1A和目標基因RHBDF2連接入受體載體(pLV[Exp]-EGFP)，得到插入了啟動子和目標序列的表達克隆，即重組慢病毒質(zhì)粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2；酶切產(chǎn)物經(jīng)回收純化后在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取重組陽性克隆，行PCR和酶切鑒定。將鑒定成功的陽性克隆于37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜，吸取部分菌液采用50%甘油保菌，剩余菌液抽提質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

1.5 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒包裝和病毒滴度測定選取生長狀態(tài)良好且匯合度達90%以上HEK293T細胞，采用胰酶消化后重懸細胞液，將細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞匯合度達60%～70%時開始轉(zhuǎn)染。慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒DNA溶液的配置：10 μg慢病毒重組質(zhì)粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2、輔助質(zhì)粒psPAX2和pMD2G各5 μg；另取1.5 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基與50 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混合均勻，室溫孵育20 min以形成轉(zhuǎn)染復合物；然后將上述復合物緩慢滴加到細胞培養(yǎng)皿中，混勻后置于37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4～6 h后，將轉(zhuǎn)染體系更換為完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后取出實驗組pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2和對照組pLV[Exp]-EGFP細胞，在倒置熒光微鏡下觀察2組細胞中GFP的表達情況并計算感染率。感染率=表達GFP細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，感染率大于90%即為轉(zhuǎn)染成功，判定轉(zhuǎn)染成功后，收集病毒上清液，4℃、3 000 r·min-1離心5 min，上清液采用0.45 μm濾器過濾，將過濾后的上清于4℃、25 000 r·min-1離心2 h，以500 μL DMEM完全培養(yǎng)基重懸病毒沉淀并于4℃冰箱溶解過夜，部分用于滴度測定，其余分裝至1.5 mL離心管保存于-80℃冰箱備用。采用倍數(shù)稀釋法測定病毒滴度，取對數(shù)生長期的HEK293T細胞按照每孔1×104個接種于96孔板，體積為100 μL。培養(yǎng)24 h后加入100 μL 不同濃度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)病毒稀釋液，準備8個無菌1.5 mL離心管，在每個管中加入90 μL含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，取10 μL待測病毒原液加入到第1個離心管中，混勻后，從中取10 μL加入到第2個管中，依次從前一個離心管中取10 μL加入后一個離心管中，直到最后一個管。在96孔板中選取所需細胞孔，棄去90 μL舊培養(yǎng)基，加入90 μL用培養(yǎng)基稀釋好的病毒液，于37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后更換為新的DMEM完全培養(yǎng)基100 μL，48～72 h后觀察GFP表達情況。正常情況下熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少，病毒滴度(TU·mL-1)=綠色熒光細胞數(shù)/相應(yīng)的慢病毒原液加入量。

1.6 篩選和建立穩(wěn)定過表達RHBDF2的EA.hy926細胞采用病毒原液感染EA.hy926細胞，于感染前1 d，選取生長狀態(tài)良好的EA.hy926細胞，按照每孔2×105個細胞接種于24孔板，待細胞融合度達50%～70%時開始實驗。慢病毒感染實驗分為2組：實驗組加入200 μL pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒進行感染，對照組加入200 μL pLV[Exp]-EGFP-control慢病毒進行感染。次日去除含病毒的培養(yǎng)基，更換為DMEM完全培養(yǎng)基。感染48 h后換用含3 mg·L-1嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進行目的細胞陽性篩選。感染72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，第4天以后隔天換用新鮮的含嘌呤霉素培養(yǎng)基替換含大量死細胞的培養(yǎng)基。待抗性細胞長滿后將細胞轉(zhuǎn)移至6孔板，繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至密度達80%時，收集部分細胞，以備后續(xù)實驗。

1.7 熒光定量PCR(qPCR)法檢測EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA表達水平分別收集對照組和實驗組EA.hy926細胞，采用TRIzol試劑提取總RNA，以該RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補的cDNA。反轉(zhuǎn)錄總體系(20 μL)：在0.2 mL PCR管中加入1 μg RNA、5×Reaction Buffer 4 μL、10×dNTP Mixture 2 μL、RNase抑制劑1 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL、Oligo dT逆轉(zhuǎn)錄引物1 μL，加入不含RNase的ddH2O至20 μL混勻，后離心，42℃、60 min，70℃、5 min，所得cDNA用于qPCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參照，分別檢測對照組和實驗組EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA相對表達水平。qPCR反應(yīng)中RHBDF2和GAPDH的引物序列：RHBDF2-F 5′-TGCTGCTATGACCCCGT-TTT-3′，RHBDF2-R 5′-CTCACGAGTCCACGGACAAA-3′，GAPDH-F 5′-AGGTCAATGAAGGGGTCGTT-3′，GAPDH-R 5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′。qPCR反應(yīng)體系(10 μL)：cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，2×SYBR Green熒光染料5 μL，無菌蒸餾水補足至10 μL。使用兩步法qPCR擴增程序，反應(yīng)條件：95℃變性10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算RHBDF2 mRNA表達水平，ΔCT值=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，ΔΔCT=實驗組ΔCT值-對照組ΔCT值。

1.8 Western blotting法檢測EA.hy926細胞中RHBDF2蛋白表達水平分別收集對照組和實驗組EA.hy926細胞制備蛋白樣品，按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明檢測并使蛋白樣品濃度一致后加入5×Loading buffer使蛋白變性。取30 μg蛋白樣品采用SDS-PAGE進行檢測，電泳條件為50 V恒壓30 min，100 V恒壓90 min。待電泳結(jié)束后取出凝膠，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA恒流100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后采用含5% 脫脂奶粉的T-BST液室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結(jié)合，封閉完成后采用T-BST洗膜3次，每次10 min。將膜剪切好后分別加入一抗，置于4 C搖床孵育過夜。次日回收一抗，T-BST洗膜3次，加入與一抗對應(yīng)種屬的二抗，室溫下孵育1 h后，T-BST洗膜3次，利用ECL化學發(fā)光劑顯影，并采用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析，計算RHBDF2蛋白表達水平。RHBDF2蛋白表達水平=RHBDF2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2過表達慢病毒載體成功構(gòu)建通過Gateway技術(shù)將目的基因RHBDF2克隆到其受體載體pLV[Exp]-EGFP上，得到pLV[Exp]-EGFP- RHBDF2慢病毒載體(圖1 A)，該載體上存在NcoⅠ酶的位點(圖1B)，采用NcoⅠ酶進行切割后通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物片段長度，酶切后電泳結(jié)果與預期結(jié)果一致(圖1C)，表明目的基因片段已成功插入到陽性克隆中。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫RHBDF2序列一致(圖2，見插頁一)，pLV[Exp]-EGFP- RHBDF2慢病毒載體構(gòu)建成功。

A：Diagram of empty vector pLV[Exp]-EGFP;B:Diagram of recombinant lentiviral vector pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2; C:Electrophoregram of enzyme identification of pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2 lentiviral vector(M:Marker;Lane 1:Empty vector;Lane 2:Recobinant vector).

圖1 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒載體的構(gòu)建和酶切鑒定

Fig.1 Construction of pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2 lentiviral vector and enzyme digestion identification

2.2 2組病慢病毒滴度和EA.hy926細胞中GFP表達將構(gòu)建好的慢病毒表達載體與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，收集慢病毒并檢測病毒滴度，對照組慢病毒滴度為1×108TU·mL-1，實驗組慢病毒滴度為3×108TU·mL-1(圖3，見插頁二)。

2.3 2組EA.hy926細胞中GFP表達感染72 h后熒光顯微鏡下顯示對照組和實驗組EA.hy926細胞中均表達GFP(圖4，見插頁二)，感染率達95%以上，表明成功建立并篩選出pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。

2.4 2組EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA表達水平與對照組(1.025±0.072)比較，實驗組EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA表達水平(3.024±0.171)升高約2倍，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=10.76，P<0.01)。

2.5 2組EA.hy926細胞中RHBDF2蛋白表達水平實驗組EA.hy926細胞中RHBDF2蛋白表達水平(2.081±0.069)較對照組(1.025±0.153)升高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=5.17，P=0.014)。見圖5。

Lane 1:Control group;Lane 2:Experiment group.

Fig.5 Electrophoregram of expressions of RHBDF2 protein in EA.hy926 cells in two groups

3 討 論

AS是一種引起心腦血管疾病的慢性炎癥性疾病，為世界范圍內(nèi)的主要致死原因。iRhoms是一種保守的蛋白亞家族，與菱形膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶有關(guān)聯(lián)，其具有獨特的結(jié)構(gòu)域，且無催化活性基序，這表明盡管缺乏蛋白酶活性，但這些蛋白仍具有重要的生物學作用[12]。據(jù)報道菱形蛋白具有多種功能：比如iRhom2可以控制ADAM17的激活，在分泌途徑中TACE的運輸需要其與iRhom2結(jié)合以促進自身的轉(zhuǎn)運與活化[13]；當機體遭受病原體入侵時，巨噬細胞會分泌大量TNF-α，這時iRhom2與TACE相互作用，促進TNF-α從TACE上脫落，使活化的TNF-α從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排出[14]；如果缺少iRhom2蛋白，TACE則不能離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因而會明顯降低TNF-α釋放量，削弱免疫保護炎癥反應(yīng)的強度[15]。此外，iRhom2的磷酸化可調(diào)節(jié)TACE刺激的蛋白水解脫落，從而從細胞表面釋放TNF-α以觸發(fā)炎癥反應(yīng)[16]。

ADAM17是一種膜表面金屬蛋白酶，是主要的脫落酶，負責釋放炎性細胞因子TNF-α和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，參與多種疾病的病理生理過程。蛋白外區(qū)脫落對細胞間相互作用至關(guān)重要，因為ADAM17控制著sTNF-α和EGFR配體的生物利用度，以及許多其他膜蛋白的釋放[17]。MATTHEW[12]發(fā)現(xiàn)：ADAM17是對凝血酶、EGFR、溶血磷脂酸和TNF-α刺激的生理信號通路快速反應(yīng)的分泌酶。細胞表面金屬蛋白酶ADAM17協(xié)調(diào)細胞與細胞之間的相互作用，在炎癥、發(fā)育、類風濕關(guān)節(jié)炎和癌癥等疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。ADAM17負責將促炎細胞因子TNF-α和大多數(shù)EGFR配體從膜錨定中釋放出來，從而密切控制TNF-α和EGFR信號通路。LI等[13]發(fā)現(xiàn)：iRhom1和iRhom2在小鼠發(fā)育過程中是ADAM17依賴性EGFR信號傳導的重要上游調(diào)節(jié)因子。iRhom2調(diào)控小膠質(zhì)細胞中依賴于ADAM17的TNF-α釋放，可能導致神經(jīng)炎癥、神經(jīng)退行性變和睡眠障礙[19]。

目前研究[20]證實：TACE對EGFR配體雙調(diào)蛋白的胞外域脫落至關(guān)重要，iRhom2對TACE的成熟和轉(zhuǎn)運到造血細胞表面起至關(guān)重要的作用。iRhom2缺陷的小鼠無法抵御單核細胞增多性李斯特菌的感染，因而認為iRhom2是天然免疫的調(diào)節(jié)子[21]。DARSHINEE等[22]發(fā)現(xiàn)：缺乏iRhom2的小鼠和缺乏TNF-α的小鼠同樣獲得了對炎癥性關(guān)節(jié)炎的免疫力。進一步的機制研究[23]顯示:補體C5a和免疫復合物可以促進iRhom2和TACE依賴的TNF-α釋放，表明iRhom2和骨髓表達的TACE在炎癥性關(guān)節(jié)炎中起重要作用，iRhom2可以作為治療風濕性關(guān)節(jié)炎的靶標。iRhom2通過氧化應(yīng)激損傷誘導巨噬細胞炎癥進而促進AS，CHENG等[11]發(fā)現(xiàn)： ox-LDL刺激引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，伴隨著丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的增加和巨噬細胞中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性的降低，iRhom2在ox-LDL誘導的巨噬細胞中表達明顯上調(diào)，而抑制iRhom2表達明顯降低了ROS的產(chǎn)生和MDA以及氮氧化合物(nitrogen oxide，NOX)水平，同時上調(diào)了GSH-px活性，并促進了核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶 1(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO1)通路的開放，表明抑制iRhom2表達可以減輕氧化應(yīng)激誘導的細胞損傷，緩解AS的進展，因此iRhom2很可能成為預防和治療慢性炎癥引起AS的潛在靶標。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒載體，并包裝成慢病毒感染EA.hy926細胞，建立了穩(wěn)定上調(diào)RHBDF2表達的細胞系。經(jīng)qPCR法和Western blotting檢測驗證了穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表達。本研究結(jié)果為進一步深入研究iRhom2/TACE/TNF-α信號通路在AS病理進程中的機制奠定了基礎(chǔ)，也為研究AS的預防和治療提供了新的靶點和方向。