miR-223-3P對肺鱗癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響

馮坤麗，羅 朋，王保龍

在中國，非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)大約占肺癌病例的85%[1]，是肺癌的主要形式，經(jīng)各種臨床手段治療的肺鱗癌患者的5年生存率仍然很低，其中肺鱗癌主要以順鉑(cisplatin、CDDP)化療為主，容易產(chǎn)生耐藥性[2]。miRNAs已知可以調(diào)控多種基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[3]。研究[4]顯示，miRNA既可以作為癌基因，也可以作為抑癌基因，并且在大多數(shù)惡性腫瘤中都表達(dá)異常。前期通過構(gòu)建肺鱗癌患者來源的移植瘤(patient derived tumor xenograft, PDTX)模型篩選出在肺鱗癌組織中下調(diào)的miR-223-3p[5]，為鑒定miR-223-3p在肺鱗癌CDDP耐藥中的調(diào)控作用，采用瞬時轉(zhuǎn)染分別上調(diào)和下調(diào)miR-223-3p的表達(dá)，研究miR-223-3p影響肺鱗癌CDDP耐藥性的分子機(jī)制，以期探究肺鱗癌診斷和治療的新型標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料肺鱗癌SK-MES-1和NCI-H520細(xì)胞株(上海生命科學(xué)研究院)；DMEM高糖培養(yǎng)基(加拿大，Wisent)；RPMI 1640培養(yǎng)基(北京全式金生物，Transgen Biotech)；胎牛血清(澳洲，Gibco)；非編碼RNA引物、miR-223-3p inhibitor、mimics及其陰性對照(NC)組(合肥通用生物、上海吉瑪公司合成)；qRT-PCR檢測試劑盒(南京諾唯贊、日本Takara公司)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁公司)；CDDP(上海Sigma公司)；細(xì)胞凋亡檢測(南京諾唯贊公司)；細(xì)胞總蛋白提取試劑(南京貝博公司)；ZEB1、E-Cadherin和Bax抗體(武漢Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)環(huán)境下，用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞，RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H520細(xì)胞。待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)90%時進(jìn)行傳代，通常按照1 ∶3或1 ∶2進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行實驗步驟，將miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor分別轉(zhuǎn)染于SK-MES-1和NCI-H520 細(xì)胞中。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-223-3p表達(dá) 細(xì)胞作相應(yīng)處理后，利用TRIzol 提取各組細(xì)胞RNA，運(yùn)用Takara 逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR 試劑盒檢測miR-223-3p表達(dá)，以U48作為內(nèi)參，以2-ΔΔCT計算miR-223-3p相對表達(dá)量。

1.2.4CCK-8法檢測細(xì)胞對CDDP藥物敏感性變化 將miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor轉(zhuǎn)染SK-MES-1和NCI-H520細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，分別向培養(yǎng)基加入 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L的7個不同濃度梯度CDDP，平行設(shè)置5個復(fù)孔。自動酶標(biāo)儀測定雙波長450 630nm處的吸光度(A)值，最終由Graphpad軟件計算出細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(half inhibition concentration，IC50)。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor分別轉(zhuǎn)染SK-MES-1和NCI-H520 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為80 μmol/L的CDDP，12 h后收集細(xì)胞，采用Annexin V FITC/PI雙染法，計算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=(早期細(xì)胞凋亡數(shù) + 晚期細(xì)胞凋亡數(shù))/ 總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞株(具有遷移能力)的Transwell遷移實驗 待測細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)90%左右，0.25%胰酶消化液消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/ml。在24孔板底部和上部分別加入600 μl含10%血清的培養(yǎng)基和100 μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)在溫箱孵育，每隔一段時間鏡下觀察，如24、48、72 h，用直尺測量細(xì)胞愈合度。

1.2.7Western blot檢測轉(zhuǎn)染后SK-MES-1細(xì)胞BCL2同源的水溶性相關(guān)蛋白(Bax)、E盒結(jié)合鋅指蛋白1(ZEB1)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)變化 將miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor轉(zhuǎn)染SK-MES-1細(xì)胞，作用72 h后提取總蛋白，離心收集蛋白上清液，BCA 法進(jìn)行濃度測定，蛋白煮沸變性后可放-80 ℃保存。以25 μg的蛋白量上樣并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏二氟乙烯膜上電轉(zhuǎn)90 min后室溫封閉2 h，再分別加入ZEB1(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶6 000)抗體，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜4 次，每次8 min。加入羊抗兔/羊抗鼠二抗(武漢Proteintech公司，1 ∶6 000稀釋)，以β-actin作為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理以上實驗均重復(fù)至少3次以上，所得數(shù)據(jù)用表示，2個獨立樣本之間均值的比較，采用的統(tǒng)計推斷方法為t檢驗，樣本統(tǒng)計量t值大小用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因干擾與過表達(dá)效率驗證通過qRT-PCR定量檢測miR-223-3p的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(miR-223-3p mimics組t=-31.00，P<0.05；miR-223-3p inhibitor組t=15.000，P<0.05)。見圖1。

A：NC-mimics； B：miR-223-3p mimics； C：NC-inhibitor； D：miR-223-3p inhibitor； 與NC-mimics比較：**P<0.05；與NC-inhibitor比較：##P<0.05

2.2 升高miR-223-3p表達(dá)增加SK-MES-1和NCI-H520肺鱗癌細(xì)胞的CDDP敏感性將miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor轉(zhuǎn)染SK-MES-1和NCI-H520細(xì)胞株，分別升高和降低細(xì)胞內(nèi)miR-223-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示升高細(xì)胞內(nèi)miR-223-3p的表達(dá)可以增加肺鱗癌細(xì)胞對CDDP藥物的敏感性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(SK-MES-1 miR-223-3p mimics組t=99.000，P<0.01；miR-223-3p inhibitor組t=-111.000，P<0.01；NCI-H520 miR-223-3p mimics組t=50.000，P<0.05；miR-223-3p inhibitor組t=-33.000，P<0.05)。見表1、圖2。

表1 肺鱗癌細(xì)胞對不同濃度CDDP敏感性的影響

2.3 干擾miR-223-3p后CDDP誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞凋亡率減少將miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor分別轉(zhuǎn)染SK-MES-1和NCI-H520細(xì)胞株，在相同劑量CDDP藥物(80 μmol/L)的誘導(dǎo)下，作用12 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，miR-223-3p mimics+CDDP組細(xì)胞凋亡增加，而miR-223-3p inhibitor+CDDP組細(xì)胞凋亡減少。見圖3。

2.4 下調(diào)肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞中miR-223-3p表達(dá)，細(xì)胞的遷移能力增加分別將miR-223-3p mimics、NC-mimics、miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor轉(zhuǎn)染SK-MES-1細(xì)胞后，Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-223-3p mimics組和NC mimics組比較，鏡下可見細(xì)胞遷移能力減弱，細(xì)胞愈合寬度miR-223-3p mimics組高于NC mimics組；同樣，miR-223-3p inhibitor組和NC inhibitor組相比較，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，細(xì)胞愈合寬度miR-223-3p inhibitor組低于NC inhibitor組，結(jié)果表明下調(diào)miR-223-3p的表達(dá)可以增強(qiáng)肺鱗癌細(xì)胞的遷移能力。見圖4。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(miR-223-3p mimicst=-13.000，P<0.05；miR-223-3p inhibitort=29.000，P<0.05)。

圖2 不同細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生存率的比較

圖3 不同細(xì)胞株轉(zhuǎn)染后分別加入相同劑量的CDDP，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化

A：SK-MES-1；B：NCI-H520；a：NC-mimics； b：miR-223-3p mimics；c：NC-inhibitor；d：miR-223-3p inhibitor；與NC-mimics比較：***P<0.01；與NC-inhibitor比較：▼▼P<0.05

2.5 肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞株過表達(dá)miR-223-3p促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)Western blot結(jié)果顯示，miR-223-3p mimics組相對于NC-mimics組，表現(xiàn)為抑癌作用，ZEB1蛋白表達(dá)量降低(t=18.333，P<0.05)，E-cadherin和Bax蛋白表達(dá)量增加(t=-39.000，P<0.05；t=-29.000，P<0.05)；而miR-223-3p inhibitor和NC-inhibitor組相比較，表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖遷移，ZEB1蛋白表達(dá)量增加(t=-99.000，P<0.01)，E-cadherin和Bax蛋白表達(dá)量減少(t=21.500，P<0.05；t=69.000，P<0.01)。見圖5。說明下調(diào)miR-223-3p的表達(dá)可以促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的遷移能力，可能通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生。

3 討論

肺癌是世界病死癌癥中最常見的癌癥之一[6]。 隨著我國工業(yè)化發(fā)展造成的環(huán)境污染加重，肺癌患病率不斷上升。肺癌中約85%為NSCLC，目前肺鱗癌最主要的治療手段包括使用鉑類藥物進(jìn)行化療，然而肺鱗癌天然耐藥，具體的耐藥機(jī)制尚不清楚[7]。近年來，大量文獻(xiàn)[8-10]報道，化療藥物CDDP、卡鉑等耐藥都與EMT息息相關(guān)，EMT可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲以及轉(zhuǎn)移，目前已經(jīng)成為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及癌癥耐藥相關(guān)分子機(jī)制研究領(lǐng)域的熱點[11]。在EMT過程中，最主要的生物標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)會減少，另外還涉及其他分子標(biāo)記物的表達(dá)變化，如波形蛋白、神經(jīng)鈣粘素、β-聯(lián)蛋白及ZEB1蛋白等[11]。通過EMT，上皮細(xì)胞失去了與基底膜的連接，從而獲得了更高的侵襲遷移能力[12]。隨著不斷興起的新型檢測技術(shù)，包括高通量測序、miRNA基因芯片檢測等，研究[13]發(fā)現(xiàn)miRNAs的差異表達(dá)水平會直接或間接的影響腫瘤分子耐藥。在慢粒急變細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)阿霉素耐藥株比其親本細(xì)胞株抑制腫瘤細(xì)胞增長需要更高的阿霉素濃度，通過基因芯片技術(shù)檢測兩者的miRNA 差異表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)耐藥株與親本株相比，其中的miR-221表達(dá)上調(diào)，而let-7f、miR-424則顯著下調(diào)，提示這些差異表達(dá)的miRNA可能影響白血病治療中的阿霉素耐藥機(jī)制研究。也有研究[14]報道食道鱗狀上皮細(xì)胞癌中miR-27a顯著下調(diào)，耐藥株與親本株相比PgP蛋白表達(dá)也下調(diào)，從而說明食道癌中差異表達(dá)的miR-27a通過影響PgP蛋白的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤耐藥。Pan et al[15]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的miR-328通過作用于靶蛋白ABCG2的3′-UTRs，抑制ABGG2的表達(dá)來提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。但是，目前相關(guān)的miRNAs的分子研究還未成熟，依然在探索階段，亟需進(jìn)一步了解miRNAs的功能為臨床診治肺鱗癌患者提供更有效的信息。

圖4 SK-MES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞
愈合寬度的變化×40

與NC-mimics比較：★★P<0.05；與NC-inhibitor比較：▲▲P<0.05

圖5 Western blot法檢測SK-MES-1細(xì)胞中ZEB1、BAX和E-cadherin蛋白的表達(dá)

A：NC-mimics；b：miR-223-3p mimics；c：NC-inhibitor；d：miR-223-3p inhibitor；與NC-inhibitor比較：**P<0.01；與NC-mimics比較：▼▼P<0.01

為了研究miR-223-3p對肺鱗癌細(xì)胞CDDP敏感性的影響，課題前期通過構(gòu)建PDTX模型，基因芯片分析成瘤組和未成瘤組的腫瘤組織，篩選出差異明顯、爭議較大且對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響的miR-223-3p。為進(jìn)一步探究miR-223-3p在肺鱗癌細(xì)胞CDDP耐藥中的作用，通過分別升高或降低肺鱗癌NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞內(nèi)miR-223-3p的含量后，CCK-8實驗證實了升高細(xì)胞內(nèi)miR-223-3p的表達(dá)可以增加肺鱗癌細(xì)胞對CDDP藥物的敏感性。在相同劑量CDDP藥物的誘導(dǎo)下，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明這種耐藥性與化療藥物誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)，上調(diào)miR-223-3p的表達(dá)可以導(dǎo)致肺鱗癌細(xì)胞凋亡比率增加。此外，Western blot結(jié)果顯示EMT相關(guān)蛋白ZEB1表達(dá)下降，E-cadherin表達(dá)顯著增高，表明miR-223-3p可能通過誘導(dǎo)EMT形成，進(jìn)而影響肺鱗癌細(xì)胞CDDP耐藥性。然而，具體的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入探索研究。

綜上所述，通過構(gòu)建PDTX模型、基因芯片技術(shù)，在肺鱗癌成瘤與未成瘤組織中篩選出肺鱗癌CDDP耐藥相關(guān)的差異表達(dá)的miR-223-3p，為下一步研究其在肺鱗癌耐藥中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。肺鱗癌組織中低表達(dá)miR-223-3p通過誘導(dǎo)EMT形成進(jìn)而促進(jìn)CDDP耐藥性，其有望成為肺鱗癌靶向治療的新的分子標(biāo)志物。