PCBP2在腸癌中的表達(dá)及功能意義

朱忠誠(chéng) ，余昌俊，陳昌裕，鄭 強(qiáng),3，康偉彪

自RNA被轉(zhuǎn)錄形成以后并不是以獨(dú)立的形式存在于細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮作用。細(xì)胞內(nèi)大量的蛋白質(zhì)與這些RNA相結(jié)合形成核糖核蛋白，在這一過(guò)程中，RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein,RBP)發(fā)揮了重要作用。Poly(rC)結(jié)合蛋白2 [Poly(rC) binding protein 2，PCBP2]是Poly(rC)結(jié)合家族的一種具有多功能適配蛋白，先前的研究主要集中于其參與病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯水平。近年來(lái)的研究[1]表明，PCBP2在腫瘤中既能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，也可以在某些腫瘤中低表達(dá)，可能也扮演了抑癌基因的角色。但目前關(guān)于腸癌組織中PCBP2的表達(dá)水平及臨床意義的研究尚未見報(bào)道，PCBP2調(diào)控腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然未知。該研究檢測(cè)了腸癌組織及鄰近的腸黏膜中PCBP2中的表達(dá)，旨在探討PCBP2對(duì)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2014年2～6月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科三病區(qū)收治的腸癌患者50例，并隨訪4年。年齡：37～82(58.33±13.64)歲，男36例，女14例；直腸癌19例，結(jié)腸癌31例(右半結(jié)腸17例，乙狀結(jié)腸12例，橫結(jié)腸2例)；高分化9例，中分化27例，低分化14例；所有患者術(shù)前均未接受抗腫瘤治療，術(shù)后病理經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科醫(yī)師明確診斷。腫瘤學(xué)分型和分期均根據(jù)WHO(2006版)標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 細(xì)胞與試劑腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)提供，DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、L-谷氨酰胺和無(wú)EDTA的胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；蘇木精染色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，三氯甲烷、EDTA、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜和異丙醇購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；6孔和96孔板購(gòu)自上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；HRP 標(biāo)記的二抗和鼠來(lái)源的Actin一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔來(lái)源的PCBP2一抗購(gòu)自美國(guó)lifespan公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化 腸癌組織及其鄰近的正常黏膜組織固定包埋后連續(xù)切片，將連續(xù)切片(5 μm厚)置于涂有10%聚賴氨酸的載玻片上。這些切片在二甲苯中脫蠟，然后通過(guò)梯度酒精重新水化。高溫和高壓可增強(qiáng)免疫反應(yīng)性，故將這些切片在高壓滅菌器中的中煮沸20 min以回收抗原，過(guò)氧化氫(0.3%)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。甩干多余的血清，滴加抗PCBP2抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，使用過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶方法對(duì)所有載玻片進(jìn)行處理。最后，將玻片用蘇木精復(fù)染色，脫水，然后固定在樹脂支架上。在奧林巴斯顯微鏡下觀察染色的切片。每張切片選取5個(gè)不同視野，由兩名主治以上的病理科醫(yī)師相互、獨(dú)立地根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率來(lái)進(jìn)行評(píng)分。半定量染色強(qiáng)度分析PCBP2的表達(dá)水平，0-4級(jí)分別為陰性、弱陽(yáng)性(<30%)，中等陽(yáng)性(30%～60%)，強(qiáng)陽(yáng)性(>60%)。免疫組化結(jié)果評(píng)分定義為染色強(qiáng)度×染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率的評(píng)分所得；免疫組化評(píng)分≥3定義為表達(dá)， <3定義為不表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 腸癌細(xì)胞HCT116用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加入10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/ml 和青霉素100 U/ml，置于5% CO2的加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育培養(yǎng)，溫度控制在37 ℃。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(根據(jù)試劑商提供的說(shuō)明進(jìn)行)，PCBP2 siRNA由上海生工合成，siRNA起始序列：CATCACTATTGCTGGCATT，空白對(duì)照組為：TTCTCCGAATGTCACGT。

1.3.4Western blot 腸癌細(xì)胞HCT116轉(zhuǎn)染72 h以后，用裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白并測(cè)出蛋白的濃度。取40 μg的蛋白樣品在的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，并置入的脫脂奶粉中常溫封閉1 h，再根據(jù)說(shuō)明書要求的比例稀釋一抗，4 ℃的條件下孵育蛋白條帶過(guò)夜。至第2 d用TBST洗去多余的一抗，并加入稀釋過(guò)的HRP(1 ∶4 000)標(biāo)記過(guò)的二抗在常溫下進(jìn)行孵育2 h，最后再用化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)蛋白的表達(dá)量，驗(yàn)證PCBP2轉(zhuǎn)染的有效性。本試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5克隆形成實(shí)驗(yàn) HCT116細(xì)胞經(jīng)過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h以后用胰酶消化并計(jì)數(shù)，取6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板一塊，每個(gè)孔接種細(xì)胞約1 000個(gè)，加入培養(yǎng)液為2 ml，為了減少誤差，每次設(shè)置3個(gè)平行孔，搖晃6孔板使細(xì)胞均勻分散，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔2天換1次培養(yǎng)基保證細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)并觀察細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)2周。PBS清洗兩遍出去細(xì)胞殘?jiān)团囵B(yǎng)液，多聚甲醛固定細(xì)胞并過(guò)夜。用結(jié)晶紫染色1 h，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆的數(shù)量并且拍照，每次設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，本試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6MTT實(shí)驗(yàn) HCT116細(xì)胞經(jīng)過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h以后用胰酶消化并計(jì)數(shù)，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板5塊，每個(gè)孔中加入轉(zhuǎn)染并計(jì)數(shù)的HCT116細(xì)胞大約1 000個(gè)，加入MTT試 劑( MTT：含10%的胎牛血清為1 ∶9) 100 μl，為了減少誤差設(shè)置6個(gè)平行孔，輕輕搖晃使細(xì)胞均勻鋪于底部。周圍加入PBS液減少水分蒸發(fā)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成的影響，置入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后每隔24 h并且連續(xù)5 d檢測(cè)每個(gè)孔中570 nm波長(zhǎng)的吸光度(optical density，OD) 值，作細(xì)胞增殖曲線，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料以K-S法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述集中趨勢(shì)，比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述集中趨勢(shì)，比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。定性資料采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸癌中PCBP2的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系PCBP2在腸癌中的陽(yáng)性率為72%，而在正常黏膜中的陽(yáng)性率僅為40%(P=0.001)，見表1；PCBP2的表達(dá)與腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.031)和病理分期相關(guān)(P=0.045)，與患者的年齡、腫瘤的大小以及腫瘤細(xì)胞的分化程度無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表1 PCBP2在結(jié)直腸癌和正常癌旁組織中的表達(dá)[n=50,n(%)]

與癌旁組織比較 ：*Z=10.390,P<0.05

表2 PCBP2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析

臨床特征nPCBP2 陽(yáng)性表達(dá)[n(%)]Z值P值年齡(歲) ≤ 55159 (60.0)1.5310.216 >553527 (77.1)腫瘤直徑 (cm) ≤53325 (75.8)0.6800.410 >51711 (64.7)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)3119 (61.3)4.6410.031 有1917 (89.5)腫瘤分化 高分化95 (55.6)1.6570.437 中分化2721 (77.8) 差分化1410 (71.4)腫瘤分期 Ⅰ+Ⅱ2817 (60.7)4.0200.045 Ⅲ+Ⅳ2219 (86.4)

2.2 PCBP2的表達(dá)與術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系術(shù)后4年隨訪發(fā)現(xiàn)，PCBP2表達(dá)陽(yáng)性的患者，無(wú)論是無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間(P=0.039)還是總生存時(shí)間(P=0.037)均小于PCBP2表達(dá)陰性的患者，見圖1。

圖1 PCBP2在腫瘤組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常黏膜中的表達(dá)及生存時(shí)間 ×200

A:PCBP2在腸癌中表達(dá)陽(yáng)性；B：PCBP2表達(dá)陽(yáng)性的患者術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間小于PCBP2表達(dá)陰性的患者；C：PCBP2表達(dá)陽(yáng)性的患者術(shù)后總生存時(shí)間小于PCBP2表達(dá)陰性的患者

2.3 PCBP2-siRNA的轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染了siPCBP2 的腸癌細(xì)胞HCT116中的PCBP2的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，見圖2A。

2.4 轉(zhuǎn)染siPCBP2對(duì)腸癌細(xì)胞增殖的影響腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞中的PCBP2被抑制后第1至5天每天檢測(cè)OD值，顯示PCBP2的低表達(dá)抑制了HCT116細(xì)胞的增殖，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2B。

2.5 轉(zhuǎn)染siPCBP2對(duì)腸癌細(xì)胞克隆形成的影響HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染了siPCBP2后，細(xì)胞的克隆形成能力明顯減低，細(xì)胞形成集落數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組(P<0.05)，見圖2C。

圖2 PCBP2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

A:干擾了PCBP2后其蛋白量下降；B：干擾了PCBP2后細(xì)胞增殖能力受抑制；C：干擾了PCBP2后細(xì)胞克隆形成能力受抑制

3 討論

PCBP2是RNA結(jié)合蛋白家族的一員，參與了mRNA的穩(wěn)定、翻譯的沉默和加強(qiáng)。以往對(duì)于PCBP2的研究主要集中在與病毒的相互作用上，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也扮演了重要的角色。本研究顯示，PCBP2在腸癌中高表達(dá)，且高表達(dá)的患者無(wú)瘤生存和總生存時(shí)間均短于PCBP2不表達(dá)的患者，這表明PCBP2可以作為腸癌預(yù)后評(píng)估的因素。國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，PCBP2在大部分的實(shí)體瘤中高表達(dá)，且其高表達(dá)預(yù)示著不良的預(yù)后。他們發(fā)現(xiàn)PCBP2在胃癌[2-3]、肝癌[4]、腦膠質(zhì)瘤[5]、食道癌[6]、乳腺癌[7]等腫瘤中表達(dá)增加，可能扮演了癌基因的角色。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2在口腔癌[8]中表達(dá)下調(diào)， 這與我們的研究結(jié)果及大部分的在腫瘤中的研究結(jié)果相反，這可能是由于基因的多功能性導(dǎo)致其在不同的腫瘤的功能不同。

在PCBP2的功能研究中，課題組發(fā)現(xiàn)，抑制PCBP2的表達(dá)可以有效地抑制腸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，提示內(nèi)源性的PCBP2對(duì)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。在對(duì)其他腫瘤的研究中，Han et al[5]研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2通過(guò)FHL3來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Chen et al[2]通過(guò)對(duì)胃癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，PCBP2通過(guò)作用于CDK2來(lái)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的生存能力；同樣地在胃癌中，Hu et al[3]發(fā)現(xiàn)，同樣地促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，PCBP2是通過(guò)作用于miR-34a來(lái)發(fā)揮其癌基因的活性。