胃癌患者唾液中篩選嘌呤代謝相關(guān)的診斷標(biāo)志物

包楚陽，向麗娟，劉 虎，汪圣毅，王亞雷

癌細(xì)胞的增殖不僅需要大量能量，對(duì)增殖合成的底物也有大量需求。而嘌呤是所有生物體最豐富的代謝底物，它不僅是RNA和DNA的核心構(gòu)建模塊之一，嘌呤代謝還提供了大量重要生物合成所需的能量和輔助因子[1-2]?，F(xiàn)通過收集178例胃癌和良性胃病患者的唾液樣本，針對(duì)胃癌的嘌呤代謝進(jìn)行分析，試圖尋找有價(jià)值的診斷標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2017年3月～2018年1月外科術(shù)后148例胃癌患者和消化內(nèi)科胃鏡室30例胃炎患者。所有入組患者均有明確組織病理學(xué)診斷。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：20140141)。已獲得所有患者和唾液供體志愿者的書面知情同意書，該研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 所有胃癌和良性疾病組患者均有明確的病理診斷；② 所有入組患者均可以收集到完整的病案資料和輔助檢查資料；③ 年齡≤80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 存在其他嚴(yán)重的心、肺、肝、腎功能異常病史及糖尿病等異常代謝疾?。虎?近期有過上呼吸道感染；③ 存在其他的口腔疾病。

1.2 標(biāo)本收集所有唾液標(biāo)本提供者在收集前1 d晚上10：00之后不允許進(jìn)食任何食物。所有標(biāo)本在收集當(dāng)天清晨使用2 ml凍存管收集，并且收集前1 h不得進(jìn)行飲水、吸煙、刷牙和劇烈運(yùn)動(dòng)。所有的唾液樣本在收集后封存于-80 ℃冰箱中，使用裝有干冰的泡沫箱封裝運(yùn)輸。

1.3 儀器與試劑Agilent 1290 UHPLC超高效液相色譜儀；AB Sciex& Agilent Triple TOF 6600/6550高分辨質(zhì)譜儀(美國Agilent)；Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17離心機(jī)(日本Thermo)；深圳市雷德邦電子有限公司PS-60AL超聲儀；Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm; 2.1×100 mm)(美國Waters)；CNW Technologies公司純度LC-MS級(jí)的甲醇、乙腈醋酸銨、氨水(德國杜塞爾多夫)；上海恒柏生物科技有限公司純度≥98% 的L-2-氯苯丙氨酸。

1.4 唾液樣本的處理將唾液樣本在4 ℃下冰上解凍，于EP管中以100/400 μl(樣本/提取液)渦旋混勻；在-20 ℃孵育以沉淀蛋白質(zhì)，離心；取新鮮上清液，在不加熱的真空濃縮器中干燥提取物，加入提取液重構(gòu)；再次渦旋超聲水浴并離心后，將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的LC/MS采樣瓶中，每個(gè)樣品取10 μl，合并為質(zhì)控 (quality control，QC) 樣品。之后對(duì)樣品進(jìn)行UHPLC-QTOF-MS 分析。

1.5 LC-MS參數(shù)和數(shù)據(jù)預(yù)處理LC-MS所用色譜柱為UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm; 2.1×100 mm)。進(jìn)樣體積為pos: 2 μl，neg:3 μl。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的分子離子譜峰進(jìn)行采集對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。轟擊能量：30 eV，每50 ms產(chǎn)生15張二級(jí)譜圖。ESI離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V(正離子模式)。再使用XCMS軟件做保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊。使用自撰寫R程序包和自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。(唾液樣本液相色譜-質(zhì)譜分析由Shanghai Biotree Biotechnology公司完成)

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析使用多元統(tǒng)計(jì)分析中的正交偏最小二乘法分析(orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)第一變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP )以及單變量統(tǒng)計(jì)分析的學(xué)生t檢驗(yàn)來篩選差異代謝物，差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)以VIP值大于1，t檢驗(yàn)以及秩和檢驗(yàn)的P<0.1為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將差異代謝物與嘌呤代謝通路映射匹配分析進(jìn)行代謝通路分析(差異代謝通路分析和差異代謝物分析由Shanghai Biotree Biotechnology公司定制R Package分析完成)。使用SPSS16.0來進(jìn)行差異受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC curve)分析，評(píng)估差異代謝物以及差異代謝物的組合對(duì)樣本進(jìn)行區(qū)分的效果，使用Fisher判別分析計(jì)算差異代謝物的診斷函數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 患者的流行病學(xué)資料本次研究征募唾液樣本志愿者共178例，年齡為25～78(59.84±11.57,P<0.001)歲，在148例胃癌患者中男性119例，女性29例；30例良性胃病患者中，男性21例，女性9例。按TNM分期來觀察，胃癌組患者中，T1患者18例；T2患者42例；T3患者76例；T4患者8例，分期不明的患者4例。

2.2 LC-MS數(shù)據(jù)處理和差異代謝物的篩選在178例受試者的唾液中共鑒定出3 638個(gè)峰，經(jīng)過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化處理后3 637個(gè)峰被保留，通過二級(jí)質(zhì)譜匹配分析得到374個(gè)常規(guī)代謝物或二級(jí)碎片，根據(jù)峰面積的強(qiáng)度值來評(píng)估代謝物的水平，經(jīng)過經(jīng)過兩組間的信號(hào)強(qiáng)度比值和OPLS-DA分析的VIP值以及組間單變量學(xué)生t檢驗(yàn)分析后得出164個(gè)代謝物用于后續(xù)分析。見表1。

2.3 嘌呤代謝物分析對(duì)嘌呤代謝通路內(nèi)92個(gè)代謝物或二級(jí)碎片，在經(jīng)過兩組間的定量比值和OPLS-DA分析的VIP值以及組間單變量學(xué)生t檢驗(yàn)分析后得出4個(gè)符合篩選卡值標(biāo)準(zhǔn)的代謝物。在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中，通常使用ROC曲線來評(píng)估差異代謝物或其組合對(duì)組間樣本的區(qū)分的效果，即通過ROC曲線評(píng)估差異代謝物的組間判別能力。在對(duì)以上4種差異代謝物進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示在胃癌患者中唾液樣本中嘌呤代謝通路內(nèi)的黃嘌呤核苷、環(huán)鳥苷酸和脫氧核苷一磷酸相較于胃良性病患者出現(xiàn)了下調(diào)，而尿酸則呈現(xiàn)上調(diào)。見圖1。

表1 差異代謝物和差異代謝通路的篩選

RT：該物質(zhì)的色譜中的保留時(shí)間；MC：該物質(zhì)在該組對(duì)比內(nèi)的癌癥組的相對(duì)定量值均值；MB：該物質(zhì)在該組對(duì)比內(nèi)的良性組的相對(duì)定量值均值；FC：Fold_Change特定代謝物在胃癌組與胃良性病組定量的比值。該表列舉幾個(gè)嘌呤代謝的中間產(chǎn)物作為示例，部分產(chǎn)物因其統(tǒng)計(jì)分析的差異值不明顯且判別分析貢獻(xiàn)值較小沒有納入下述的診斷模型；篩選卡值標(biāo)準(zhǔn)：VIP值>1，P<0.1

圖1 嘌呤代謝通路中4個(gè)差異代謝物的ROC曲線

脫氧核苷一磷酸曲線下面積(area under curve, AUC)=0.38(95%CI=0.27～0.49)；黃嘌呤核苷AUC=0.294(95%CI=0.20～0.39)；環(huán)鳥苷酸AUC=0.13(95%CI=0.06～0.19)；尿酸AUC=0.711(95%CI=0.61～0.81)

2.4 嘌呤代謝物的診斷函數(shù)模型針對(duì)上述分析結(jié)果中的4種差異代謝物使用Fisher判別分析建立差異代謝物的診斷函數(shù)模型。

診斷函數(shù)：y1=65.973x1+24.766x2-22.641x3-0.2x4-1.489

y2=32.690x1-22.685x2+29.897x3+13242x4-1.137

上述函數(shù)中x1為唾液中的黃嘌呤核苷，x2為環(huán)鳥苷酸，x3為脫氧核苷一磷酸，x4為尿酸。若單個(gè)樣本的y1值大于y2，則視為良性胃病，若y1小于y2則將其視為胃癌，P=0.013。使用留一法交叉驗(yàn)證分析得出該模型的靈敏度為83.1%，特異度為63.3%。

3 討論

目前已有多項(xiàng)針對(duì)膀胱癌、乳腺癌等多個(gè)癌種進(jìn)行了代謝組學(xué)相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)癌癥患者的血液、尿液以及呼氣中有多種明顯差異的代謝物，在經(jīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)整合分析后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異代謝物與嘌呤代謝密切相關(guān)[3-4]。本次研究收集了148例胃癌患者和30例胃良性病患者的唾液進(jìn)行UHPLC-QTOF-MS分析，篩選出4個(gè)較明顯的差異代謝物，分別為環(huán)鳥苷酸、黃嘌呤核苷、腺嘌呤脫氧核苷以及尿酸。相較于良性胃病的患者，在胃癌患者的唾液中環(huán)鳥苷酸、黃嘌呤核苷和腺嘌呤脫氧核苷出現(xiàn)下調(diào)，而尿酸呈上調(diào)。

在人體內(nèi)，嘌呤核苷酸的合成方式有2種，一種是從頭生物合成(de novo synthesis)途徑，另一種是互補(bǔ)的補(bǔ)救合成途徑。從頭合成主要中間產(chǎn)物為肌苷一磷酸(inosine monophosphate, IMP)，IMP可以繼續(xù)通過中間產(chǎn)物黃嘌呤一磷酸(xanthine monophosphate, XMP)合成為鳥嘌呤一磷酸(guanosine monophosphate, GMP)或者直接合成腺嘌呤一磷酸(adenosine monophosphate, AMP)、GMP和AMP 繼續(xù)進(jìn)入各自的循環(huán)并最終合成DNA或RNA，由于腫瘤細(xì)胞不受限制增殖產(chǎn)生了其對(duì)RNA、DNA大量需求，這可能導(dǎo)致鳥嘌呤、腺嘌呤代謝循環(huán)的改變以及環(huán)鳥苷酸和脫氧核苷一磷酸相應(yīng)的下調(diào)。另外的補(bǔ)救合成途徑主要存在于缺乏從頭合成的細(xì)胞或組織中，通過循環(huán)回收堿基來合成嘌呤核苷酸以滿足機(jī)體平時(shí)的代謝需求。在本次研究中幾種嘌呤核苷酸的相應(yīng)衍生物如鳥苷、腺苷、肌苷均出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，其中黃嘌呤核苷最為明顯。大致代謝過程見圖2。

對(duì)于腫瘤細(xì)胞，由于從頭生物合成能夠產(chǎn)生巨大能量和各種細(xì)胞原材料，可以滿足癌細(xì)胞的各種增殖需求。在腫瘤組織中，由于補(bǔ)救合成途徑的中間代謝物被用于細(xì)胞增殖而次黃嘌呤的回收途徑利用率下降，導(dǎo)致了嘌呤降解增加從而產(chǎn)生了尿酸的上調(diào)，最近也有研究[5-6]顯示血清中的尿酸濃度可以作為評(píng)估乳腺癌的預(yù)后因素。而鳥苷一磷酸、脫氧腺苷一磷酸以及黃嘌呤核苷這3種代謝物目前在

圖2 嘌呤的補(bǔ)救合成途徑

橙色箭頭：從頭合成方式(de novo synthesis)；綠色箭頭：嘌呤補(bǔ)救合成途徑；紅色箭頭：嘌呤降解，最終產(chǎn)物為尿酸；深色標(biāo)記的4個(gè)代謝物為本次研究的診斷標(biāo)記物；綠色：下調(diào)，紅色：上調(diào)

嘌呤代謝通路內(nèi)的作用未發(fā)現(xiàn)有研究揭示說明。對(duì)于本次研究所發(fā)現(xiàn)的在胃癌患者唾液樣本中這3種代謝物出現(xiàn)的不同程度下調(diào)的原因，推測(cè)可能與腫瘤組織不受限制的增殖需求以及腫瘤環(huán)境中嘌呤代謝途徑改變有關(guān)，但其具體的分子水平代謝機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步的體外細(xì)胞試驗(yàn)來探索和證實(shí)[7-8]。