肝細胞癌中膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的表達及意義

王珊珊，汪 靜，張 浩，王 琴，楊 凱，管世鶴

肝癌是全球病死率最高的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關死亡的第二大原因[1]，特別是在發(fā)展中國家。在我國每年有近38萬人死于肝癌，面對如此嚴峻的形勢，肝癌的治療備受關注。鐵是人體必不可少的微量元素之一，在人體中參與腺嘌呤核苷三磷酸 (adenosine triphosphate，ATP)的合成，氧的運輸及DNA合成等多種代謝過程，而膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)作為唯一已知的鐵離子輸出蛋白，在體內(nèi)廣泛分布，是參與機體鐵代謝的重要調(diào)節(jié)因子。已有研究[2- 3]表明，鐵代謝紊亂引起的過量鐵離子與腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移及預后有關。該研究擬通過分析FPN在肝細胞癌中表達及與患者的分期和預后的關系，闡明FPN可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展起到的作用，為肝細胞癌的免疫治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2017年3月～2019年3月安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科血清169例。肝癌組80例，慢性肝病組48例，健康對照組血清41例。肝癌組男58例，女22例，年齡在28～86(52.61±13.61)歲；慢性肝病組男38例，女10例，年齡在27～75(47.40±11.17)歲；健康對照組男25例，女16例，年齡在16～80(48.98±14.30)歲。 收集2017年3月～2018年8月安徽醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院病理科石蠟包埋的肝組織46例、肝癌組織32例、正常肝良性病變肝組織14例。肝癌組織男28例，女4例，年齡在39～70 (56.87±13.39) 歲。肝良性病變肝組織男6例，女8例，年齡在55～69(62.71±5.99)歲。所有受檢人員性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義，且均未服用華法林抗凝劑、維生素K及維生素K拮抗劑等藥物。

1.2 納入標準和排除標準納入標準： ① 所有肝癌患者均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017版)》診斷標準；② 所有慢乙肝患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》診斷標準；③ 血清標本的選擇均為受檢者入院后第1次檢測。排除標準：① 排除其他惡性腫瘤；② 排除其他肝臟病史如肝移植病史，轉(zhuǎn)移性肝癌等。

1.3 主要儀器與試劑FPN抗體購自美國Abcam公司；普魯士藍鐵染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；免疫組化試劑購自安徽欣樂生物技術有限公司；人膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物技術公司。奧林巴斯CR23顯微鏡觀察免疫組化結果，Roche601電化學發(fā)光儀檢測甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)， KHB-ST-360酶標儀讀取FPN吸光度值，Siemens2000全自動生化儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)水平，Mindray6800血常規(guī)分析儀檢測血紅蛋白(hemoglobin，Hb)水平。

1.4 方法

1.4.1普魯士藍鐵染色檢測肝癌組織鐵沉積 肝組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次，用不同濃度梯度的乙醇(100%、95%、90%、85%)水化。Perls stain染液染色15～30 min，蒸餾水充分沖洗5～10 min后，伊紅染液復染15～30 s,蒸餾水沖洗3～5 s。最后乙醇(90%、95%、100%)脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。普魯士藍鐵染色結果判斷：無藍色鐵顆粒沉積為陰性，有藍色鐵顆粒沉積為陽性。

1.4.2免疫組化檢測FPN在肝組織中的表達 將石蠟組織切片在二甲苯中脫蠟，并根據(jù)標準方案在降序乙醇系列中再水合。在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中在100 ℃下進行熱誘導的抗原修復20 min。酶消化的抗原修復在0.1%胰蛋白酶中于37 ℃進行25 min。然后用血清封閉切片30 min，然后與兔抗SLC40A1抗體在37 ℃溫育1～2 h。洗滌后，將切片與辣根過氧化物酶-山羊抗兔抗體在37 ℃溫育30 min。用DAB緩沖底物中的3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色過氧化物酶反應。用DAB顯示切片并用蘇木精復染，安裝在中性膠中并使用明視野顯微鏡分析。使用鼻咽癌病理切片作為陰性對照，并用PBS代替一抗。為了評估IHC結果，使用Image-J軟件對免疫組化結果進行分析判讀。

1.4.3ELISA檢測FPN在肝癌患者和正常健康對照者血清中的表達 將標準品工作液與待測樣品依次加入酶標板孔中每孔100 μl，覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去液體不用洗滌，每孔直接加入生物素化抗體工作液100 μl，覆膜，37 ℃孵育60 min；甩盡孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液350μl，浸泡1～2 min后拍干，重復洗滌3次；加入酶結合物工作液100 μl，覆膜，37 ℃孵育30 min，同上洗滌5次；每孔加入底物溶液90 μl，覆膜，37 ℃避光孵育15 min后加入終止液50 μl，終止反應，立即使用酶標儀在波長450 nm波長測量各孔OD值。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析,其中正態(tài)數(shù)據(jù)采用均數(shù)和標準差表示，偏態(tài)數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌患者肝組織中肝鐵沉積普魯士藍鐵染色結果顯示，肝癌組織中鐵沉積明顯高于肝良性病變組織(圖1)，肝癌組織出現(xiàn)明顯的藍色鐵沉積，而肝良性病變組織中無藍色鐵顆粒，以上結果提示肝癌患者較對照組織中出現(xiàn)鐵代謝紊亂，并發(fā)生肝鐵沉積現(xiàn)象。

圖1 HCC和肝良性病變組織普魯士藍鐵染色 ×200

2.2 FPN在血清中的表達水平健康對照組、慢性肝病組和肝癌組生化指標水平比較中顯發(fā)現(xiàn)ALT、AST、TBIL、Hb、FPN三組均有差異(表1)，且肝癌組患者血清中FPN表達水平明顯高于健康對照組和慢性肝病組(圖2)。再對肝癌患者進行臨床特征分析，發(fā)現(xiàn)患者的Child-pugh肝功能分級(P<0.05)，BCLC肝癌分期(P<0.05)，轉(zhuǎn)移(P<0.05)與FPN表達水平差異有統(tǒng)計學意義，與結節(jié)數(shù)目、腫瘤的大小(P>0.05)差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

2.3 FPN在肝組織中的表達免疫結果顯示，肝良性病變組織中細胞膜和細胞質(zhì)中無明顯的棕黃色染色，而肝癌組織細胞膜和細胞質(zhì)中有明顯的棕黑色染色(圖3)，肝癌患者肝組織中FPN% Area中FPN(9.718±8.005)明顯高于肝良性病變患者肝組織中FPN% Area (2.669±2.231)，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.361,P<0.05)。

表1 健康對照組、慢性肝病組和肝癌組生化指標水平比較[M(P25,P75)]

與健康對照組比較：#P<0.05；與慢性肝病組比較：*P<0.05

圖2 血清中FPN表達

與健康對照組比較：#P<0.05；與慢性肝病組比較：*P<0.05

表2 FPN與肝癌患者臨床特征的相關性[M(P25,P75)]

圖3 肝組織免疫組化染色

3 討論

我國是肝癌大國，每年新發(fā)病例和死亡病例都占到全球的50%以上。據(jù)統(tǒng)計，我國的肝癌患者，以巴塞羅那分期B和C期為主，占到所有肝癌患者的80%以上，C期在我國肝癌患者中占到50%以上，大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時即為晚期，而早期肝癌的診出率不足30%，晚期肝癌的五年生存率不足20%，而及時進行規(guī)范治療后，早期肝癌的5年生存率已超過70%[4]。因此，尋找有效的靶基因?qū)Ω伟┑脑缙谠\斷早期治療是尤為重要的。

人FPN基因位于2號染色體上，其mRNA編碼的FPN有571個氨基酸，分子量約62 000，在體內(nèi)廣泛分布，在脾臟、肝臟、十二指腸、心臟等細胞中均有表達。肝臟中，F(xiàn)PN主要表達在枯否細胞的細胞質(zhì)，肝細胞的竇周邊緣[5]。FPN是機體鐵代謝的重要調(diào)節(jié)因子，將細胞內(nèi)游離鐵轉(zhuǎn)運至胞外，其變化會使腫瘤細胞更具侵襲性。因此，F(xiàn)PN異常引起的鐵代謝失衡通常會引起腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Geng et al[6]提出，敲低FPN可加速誘導神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生鐵死亡。Shan et al[7]發(fā)現(xiàn)，抑制FPN表達可刺激三陰性乳腺癌細胞的增殖、EMT和遷移。Wang et al[8]發(fā)現(xiàn)FPN與肝癌預后有一定的相關性。薛冬 等[9]發(fā)現(xiàn)FPN在前列腺癌細胞株和患者癌組織中均低表達，可能與其參與鐵調(diào)節(jié)相關，由此可見，F(xiàn)PN可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

本研究首先通過普魯士藍鐵染色發(fā)現(xiàn)肝癌患者肝組織中已出現(xiàn)鐵沉積，表明肝癌患者體內(nèi)已出現(xiàn)鐵紊亂現(xiàn)象，再通過免疫組化與ELISA分析出肝細胞癌患者體內(nèi)肝組織和血清中FPN的表達均高于對照組(P<0.05)，進一步分析患者的臨床特征也得出FPN的表達程度與患者的Child-pugh肝功能分級，BCLC肝癌分期，轉(zhuǎn)移呈正相關。這與Wang et al[8]研究得出的肝癌患者組織中FPN低表達相矛盾，一方面可能由于肝臟發(fā)生鐵過載現(xiàn)象，機體反饋性的上調(diào)鐵調(diào)素的分泌水平，而FPN是已知的哺乳動物唯一的鐵輸出蛋白，需鐵調(diào)素結合，發(fā)揮作用，減少鐵的吸收，細胞內(nèi)釋放鐵離子至血液減少，改善體內(nèi)的鐵過載現(xiàn)象；另一方面，F(xiàn)PN在肝臟的亞細胞定位主要集中在枯否細胞胞質(zhì)中，腫瘤細胞侵犯肝臟細胞時致使枯否細胞發(fā)揮吞噬和清除功能，F(xiàn)PN從胞質(zhì)釋放進入血清[10-11]，導致FPN在肝癌患者體內(nèi)高表達。

綜上所述，我們認為FPN在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，可作為肝細胞癌免疫治療的一個新的靶點。其機制可能是FPN作為鐵輸出的重要調(diào)節(jié)因子， 其mRNA可被高水平的細胞內(nèi)鐵促進[11]，在肝細胞發(fā)生腫瘤時，細胞內(nèi)鐵含量增高，鐵依賴的FPN表達增加，會將細胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)移到細胞外，延緩細胞內(nèi)鐵超載，因此細胞內(nèi)鐵濃度升高會引發(fā)FPN補償性的負反饋調(diào)節(jié)，有利于肝細胞內(nèi)鐵含量的穩(wěn)定，從而保護組織免受鐵超載的傷害[5]，而鐵超載會使細胞內(nèi)活性氧增加，可致腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡，然而鐵死亡[12]作為一種新型的細胞死亡方式在肝細胞癌中起著重要作用[13-14]，F(xiàn)PN升高使得肝癌細胞逃避鐵死亡。但是FPN參與肝癌細胞鐵死亡的分子機制仍有待于研究。