橋本甲狀腺炎對孕鼠額葉谷氨酸及其轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響

柳田田，楊 昊，夏 琴，程 錦，吳章碧，王 囡，朱德發(fā)

橋本甲狀腺炎(hashimoto’s thyroiditis，HT)是常見的自身免疫性甲狀腺疾病，發(fā)病率0.3% ～ 10%，女性高發(fā)。其特征為甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，部分甲狀腺濾泡破壞以及血清自身抗體甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody,TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)的增加[1]。相關(guān)研究[2]表明，妊娠期女性血清抗TPOAb水平與情緒障礙有著明顯關(guān)系。有文獻(xiàn)[3]指出情緒障礙與谷氨酸能系統(tǒng)功能障礙有關(guān)。谷氨酸(glutamic acid, Glu)具有廣泛的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[4]。高濃度的Glu產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，Glu在神經(jīng)元細(xì)胞外維持低濃度主要依賴于Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)[5]。課題組前期研究[6]顯示，HT可導(dǎo)致小鼠額葉Glu含量增加，額葉是影響情緒行為的關(guān)鍵大腦區(qū)域。現(xiàn)試圖探討小鼠在妊娠狀態(tài)下，HT對額葉Glu水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡健康NOD雌性小鼠50只、NOD雄鼠10只，購自北京華阜康生物科技有限公司，體質(zhì)量20～23 g，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度21～23 ℃, 濕度 (55±5)%，實(shí)驗(yàn)過程遵循《安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》。

1.2 主要試劑及儀器豬甲狀腺球蛋白(porcinethyroglobulin，pTg)、完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)(美國Sigma公司); 三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)試劑盒、四碘甲狀腺原氨酸 (tetraiodothyronine，T4)試劑盒、甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)(德國Roche公司); 促甲狀腺激素(thyroid stimulatinghormone， TSH) ELISA試劑盒(武漢云克隆、CEA463Mu); Glu ELISA 試劑盒(武漢華美公司)；兔單克隆抗體囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vesicular glutamate transporter, VGLUT)1、興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(excitatory glutamate transporter，EAAT)2及內(nèi)參一抗GAPDH(美國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(美國Millipore公司)；超敏顯影液(美國Thermo公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(上海 Tanon公司)；高速臺式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；低速迷你離心機(jī)(海門市其林貝爾儀器制備有限公司)；普通PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；微板孔迷你離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量 PCR儀(美國Thermo Scientific公司)；形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus 6.0，美國 Media Cybernetics公司)。

1.3 制備動(dòng)物模型適應(yīng)性喂養(yǎng)50只NOD雌性小鼠1周后，隨機(jī)分成2組，即CON組(20只)和 HT組(30只)。在100 μl生理鹽水中溶入25 μg pTg ，分別在一次性注射器中吸入等量CFA與pTg溶液，接通三通管，冰浴條件下研磨至完全乳化。隨后固定小鼠，在HT組小鼠尾根部1 cm處用一次性注射器皮下注射乳狀劑0.1 ml。在CON組注射等量不含pTg的CFA 乳化劑。14 d后將CFA替換成IFA，與pTg制備成乳化劑，同樣操作方法在每只HT組小鼠尾根部1 cm處皮下注射0.1 ml乳化劑。在CON組注射等量不含 pTg的IFA乳化劑。造模周期49 d。造模成功后，將各組雌鼠與健康NOD雄鼠2：1合籠建立妊娠模型。實(shí)驗(yàn)經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.4 方法

1.4.1妊娠小鼠模型制備 將造模成功的雌鼠與健康雄鼠隨機(jī)分組合籠，雌雄比2 ∶1，每日19：30-20：00合籠，次日7：00-7：30觀察雌鼠陰道口是否有陰栓，若有陰栓判斷為已交配，取出另籠飼養(yǎng)，記為受孕0.5 d。

1.4.2血清甲狀腺激素水平測定 取2組孕鼠各15只經(jīng)水合氯醛麻醉后眼眶靜脈取血1 ml，4 ℃冰箱靜置4～6 h，4 000 r/min離心15 min，分離血清并于4 ℃ 冰箱保存。ELISA法檢驗(yàn)血清TSH水平，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢驗(yàn)血清T3、T4、TPOAb、TgAb水平。

1.4.3標(biāo)本制備 妊娠4.5 d小鼠取血后立即斷頭處死，冰上迅速分離腦組織，取額葉置于-80 ℃冰箱保存。2組各分離6只小鼠甲狀腺，4%多聚甲醛中固定分離的甲狀腺，置于搖床上24 h后，石蠟包埋，連續(xù)切成5 μm厚薄片。

1.4.4HE染色 將甲狀腺切片脫蠟、復(fù)水，蘇木精染色后水洗，鹽酸乙醇分色、藍(lán)化，伊紅染色后水洗，再經(jīng)脫水、透明后烘干封片。光學(xué)顯微鏡下拍攝圖片。

1.4.5ELISA法檢測谷氨酸水平 2組各取6只左腦額葉組織加入300 μl PBS (pH 7.4)冰上勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，收集上清液。按Glu的ELISA試劑盒說明操作：配置標(biāo)準(zhǔn)品與洗滌液；將50 μl標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)包被板的標(biāo)準(zhǔn)孔中；樣品孔加入樣品稀釋液40 μl后加入樣品10 μl(最終稀釋度為5倍)；每孔加入酶標(biāo)試劑100 μl；空白孔不加入酶標(biāo)試劑及樣品；封板膜封板后37 ℃溫育1 h；棄去液體，洗滌液重復(fù)洗滌各孔5次；每孔相繼加入顯色劑A、顯色劑B各50 μl，輕輕震蕩混勻后37 ℃避光顯色15 min；各孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀450 nm波長測量各孔的吸光度(optical density，OD)值;對照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品的Glu濃度。

1.4.6Western blot法檢測VGLUT1、EAAT2蛋白表達(dá)水平 2組孕鼠各取3只右腦額葉，按100 ∶1混勻組織裂解液和蛋白酶抑制劑后，加右腦額葉并冰上勻漿，4 ℃、15 000 r/min離心15 min ，取上清液再次4 ℃、15 000 r /min離心15 min，取上清液按BCA試劑盒方法測定蛋白濃度; 使用2×上樣緩沖液稀釋定量，100 ℃、10 min 蛋白變性，分裝-20 ℃保存；制膠，每組取蛋白樣本 20 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上;麗春紅染色，三蒸水洗滌3次7 min；5%脫脂牛奶封閉2 h，三蒸水洗滌3次7 min;加入不同一抗(VGLUT 1 1 ∶1 000，EAAT 2 1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶4 000)4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，PBS洗膜10 min;加入HPR相應(yīng)二抗(VGLUT 1/EAAT 2 1 ∶80 000，2 h; GAPDH 1 ∶150 000)室溫孵育40 min；PBST洗膜3次，每次10 min，PBS洗膜10 min；滴加超敏顯影液后置于化學(xué)發(fā)光成像儀中拍攝蛋白條帶；Image proplus圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參對照GAPDH的灰度值比值。

1.4.7RT-qPCR法檢測VGLUT1、EAAT2 mRNA水平 2組各取8只額葉組織60 mg，剪碎研磨，加入1 ml TRIzol勻漿，加0.2 ml氯仿，振蕩15 s，室溫孵育5 min后離心，加0.5 ml預(yù)冷異丙醇，混勻，冰上孵育30 min后離心棄上清液，加1 ml預(yù)冷75%乙醇后離心棄上清液，室溫干燥RNA沉淀，加50 μl DEPC水，-80 ℃保存；在0.2 ml EP管中，加入總RNA (質(zhì)量為1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、DEPC水補(bǔ)足至11 μl后混勻，進(jìn)行離心、加熱、冰浴；上述EP管中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、RibolockTM Rnase inhibitor 1 μl、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl；42 ℃、60 min， 70 ℃、5 min；取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。取出cDNA作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系：2×SYBR Green mixture 5 μl；Forward primer(10 μmol/L)1 μl；Reverse primer(10 μmol/L)1 μl；cDNA 1 μl；不含RNase 的純水2 μl；反應(yīng)條件:95 ℃ 變性2 min；95 ℃退火5 s；60 ℃延伸10 s，3個(gè)步驟進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。熒光定量結(jié)果用2-ΔΔCt進(jìn)行分析。各基因引物序列見表 1。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠血清甲狀腺激素及抗體水平兩組T3、T4、TSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HT組TgAb、TPOAb水平較CON組升高(P<0.05)。見表 2。

表2 各組孕鼠T3、T4、TSH、TgAb、TPOAb水平

與CON組比較:*P<0.05

2.2 兩組孕鼠甲狀腺HE染色情況對比與CON組相比，HT組孕鼠甲狀腺內(nèi)可見部分甲狀腺濾泡破壞及大量淋巴細(xì)胞浸潤。見圖1。

2.3 兩組孕鼠額葉谷氨酸含量比較ELISA法檢測結(jié)果顯示，CON組孕鼠額葉Glu濃度水平低于HT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 孕鼠甲狀腺組織HE染色 ×200

圖2 兩組孕鼠額葉Glu水平的表達(dá)與CON組比較：*P<0.05

2.4 兩組孕鼠額葉VGLUT1、EAAT2蛋白表達(dá)水平情況HT組孕鼠額葉組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT 1蛋白表達(dá)較CON組孕鼠降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 與CON組相比，HT組額葉組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT 2的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

A：VGLUT 1和EAAT 2在孕鼠額葉中的蛋白表達(dá)的情況; B:兩組VGLUT 1蛋白表達(dá)；C：兩組EAAT 2蛋白表達(dá);與CON組比較：*P<0.05

2.5 兩組孕鼠額葉VGLUT1、EAAT2 mRNA表達(dá)情況與 CON組相比，HT組額葉組織中VGLUT 1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩組額葉中EAAT 2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 兩組孕鼠VGLUT 1、EAAT 2 mRNA表達(dá)水平

與CON組比較:*P<0.05

3 討論

本研究通過將pTg結(jié)合弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑注射于NOD小鼠尾根部建立HT動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7]，結(jié)果顯示HT組小鼠僅表現(xiàn)TgAb和TPOAb升高，甲狀腺HE染色結(jié)果見大量淋巴細(xì)胞浸潤及部分甲狀腺濾泡破壞，提示HT造模成功。HT造模成功后，將健康NOD雄鼠與2組小鼠合籠，選取妊娠小鼠。

課題組前期對HT小鼠進(jìn)行研究[6]，顯示HT小鼠額葉Glu較CON組升高；本實(shí)驗(yàn)通過對孕鼠的研究，顯示HT組孕鼠額葉Glu含量高于CON組；有文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]對多發(fā)性硬化癥患者的研究，發(fā)現(xiàn)血清Glu含量及腦脊液Glu水平升高，多發(fā)生情緒障礙。Kashanian et al[2]的研究顯示在甲狀腺功能正常的孕婦中，妊娠早期血清抗TPOAb陽性比血清抗TPOAb陰性的孕婦焦慮與抑郁增加更明顯。這提示了HT可能是導(dǎo)致孕婦情緒改變的一個(gè)關(guān)鍵因素，推測其機(jī)制可能與腦內(nèi)Glu水平相關(guān)。有報(bào)道[10]進(jìn)一步表明HT可能導(dǎo)致大腦失衡，其機(jī)制可能是抗TPOAb水平與T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子相關(guān)。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子α和干擾素γ顯著增加，這些炎性因子可能通過改變其自身的合成，釋放和再攝取影響神經(jīng)遞質(zhì)Glu的水平。

Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體能攝取轉(zhuǎn)運(yùn)Glu，保護(hù)神經(jīng)元免受谷氨酸能過度信號傳遞產(chǎn)生的興奮性毒性，其表達(dá)降低，可造成Glu堆積在突觸間隙[5]。Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體分為VGLUTs與EAATs。研究[11]顯示，突觸間隙中的Glu濃度由介導(dǎo)Glu胞吐釋放的VGLUTs和增加Glu再攝取的EAATs調(diào)節(jié)。VGLUTs能特異性地將神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的Glu轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸囊泡內(nèi)，其主要分布于囊泡膜上，有3種亞型(VGLUT 1-3)，VGLUT 1最重要[5,12]。EAATs有5種亞型(EAAT 1-5),其中EAAT 2主要表達(dá)于神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上，以高親和力運(yùn)輸Glu，負(fù)責(zé)將Glu從突觸間隙中清除，維持低水平的細(xì)胞外Glu[5,13]。本研究中Western blot法表示，HT組額葉中VGLUT 1蛋白表達(dá)水平較CON組降低。RT-qPCR結(jié)果顯示，與CON組相比，HT組VGLUT 1的mRNA表達(dá)降低。2種方法中EAAT 2的蛋白表達(dá)水平與mRNA表達(dá)雖有下調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究[12,14]發(fā)現(xiàn)，模擬嚴(yán)重抑郁癥行為模型中，小鼠前腦VGLUT 1水平的降低，能引起Glu水平的增加。自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓Glu攝取上調(diào)伴隨著EAAT 2蛋白水平降低。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HT妊娠小鼠額葉內(nèi)VGLUT 1表達(dá)水平降低，可能不能有效的將神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生和在攝取的Glu儲(chǔ)存于突觸囊泡內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞外Glu的堆積。

綜上所述，HT可導(dǎo)致孕鼠額葉Glu含量升高，Glu轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT 1蛋白表達(dá)下降。該結(jié)果提示HT可導(dǎo)致Glu代謝紊亂，為妊娠HT患者的情緒障礙提供一定的理論依據(jù)。