轉(zhuǎn)錄因子LMO4調(diào)控前列腺癌細胞增殖及其機制

郭立鈺，劉蒙蒙，涂珍珍，曾凡軍，尹 玉，詹鶴琴，周海勝

前列腺癌是男性常見的腫瘤之一，在中國、以色列等亞洲的42個國家和地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)前列腺癌的發(fā)生率位居男性腫瘤的前3位[1-2]。在前列腺癌細胞中，CD133+細胞表現(xiàn)出較強的克隆形成能力和抗放化療能力，提示前列腺癌晚期患者出現(xiàn)治療抵抗和癌轉(zhuǎn)移可能與CD133+細胞有關(guān)[3-4]，但CD133表達的調(diào)控機制目前不清楚。

LIM結(jié)構(gòu)域蛋白4(LIM-domain protein 4, LMO4)屬于LMO家族成員，是核轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于胚胎和成人的各個組織中，在胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)神經(jīng)、皮膚、耳蝸等組織發(fā)育[5-7]。研究[8]顯示在造血細胞成熟過程中LMO4與LIM域結(jié)合蛋白1(LIM domain binding protein, LDB-1)、細胞周期依賴性激酶9(cyclin-dependent kinase, CDK9)等形成復合體調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化。過去研究[9-10]證實LMO4影響多種腫瘤細胞的增殖與分化，在乳腺癌、非小細胞型肺癌、鱗狀細胞癌、胰腺癌等腫瘤中LMO4的表達量均顯著增加，但LMO4是否參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚 。該研究觀察LMO4對前列腺癌細胞CD133蛋白表達和增殖能力的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本、細胞系與載體 前列腺癌和前列腺增生組織切片由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科提供，其中前列腺癌組織10例，前列腺增生組織7例。人前列腺癌細胞系PC-3由安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院張力博士惠贈，人前列腺細胞系PET2-TGC由上海中醫(yī)藥大學柯細松教授惠贈。干涉Lmo4所使用的慢病毒載體GV248、人慢病毒干涉質(zhì)粒shRNAb-Lmo4和shRNAc-Lmo4和過量表達的人LMO4慢病毒(GV320)均購自上海吉凱基因公司。干涉人Lmo4所用寡核苷酸序列見表 1，均由上海生工有限公司合成。

1.1.2試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基和F12 HAM’S培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素/鏈霉素混合液(P/S)購自北京索萊寶科技有限公司；鼠源抗Flag抗體購自美國Sigma公司；兔源抗LMO4抗體購自英國Biorbyt公司和美國Sigma公司；兔源抗CD133抗體購自英國Abcam公司；兔源抗CDK9抗體和瓊脂糖珠均購自美國Cell Signaling公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；EDU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

表1 寡核苷酸序列

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人前列腺癌細胞系PC-3使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，人前列腺細胞系PET2-TGC使用含10%胎牛血清、1% 青鏈霉素的F12 HAM’S培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2細胞系構(gòu)建 取處于對數(shù)生長期的PC-3細胞，均勻接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。使用Lipofectamine?3000試劑將人慢病毒干涉質(zhì)粒shRNAb-Lmo4和shRNAc-Lmo4轉(zhuǎn)染至PC-3細胞，48 h后更換培養(yǎng)基。加入嘌呤霉素使終濃度達到40 μg/ml篩選6 d，構(gòu)建穩(wěn)定干涉Lmo4的前列腺癌細胞系PC-3/SiLmo4。

1.2.3Western blot實驗 根據(jù)文獻[11]方法收集細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉。分別孵育兔源抗LMO4 (1 ∶1 000)、CD133(1 ∶1 000)、CDK9(1 ∶1 000)抗體和鼠源抗GAPDH抗體 (1 ∶5 000)等，4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育3 h，ECL發(fā)光試劑反應，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4蘇木精-伊紅(HE)染色實驗 病理組織切片經(jīng)過脫蠟入水處理，蘇木精染核2 min，伊紅染色10 s，流水沖洗30 min，65 ℃烘干，中性樹脂封片。

1.2.5免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC) 組織切片經(jīng)過脫蠟入水處理，檸檬酸鹽修復，內(nèi)源性過氧化物酶封閉。兔源抗體LMO4、CD133 4 ℃孵育過夜，先后滴加反應增強液和增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育30 min后，DAB顯色，蘇木精染核，流水沖洗，烘干，中性樹脂封片。

1.2.6流式細胞分析和分選技術(shù) 胰酶消化收集細胞，加入兔源抗CD133抗體， 37 ℃孵育45 min，PBS清洗收集細胞。帶熒光標記的二抗標記細胞，37 ℃孵育30 min。PBS清洗，重懸細胞，流式細胞儀分析CD133+細胞數(shù)或分選CD133+細胞數(shù)。

1.2.7細胞增殖實驗 分別采用EDU摻入實驗和細胞克隆形成實驗以觀察前列腺癌細胞增殖能力。其中，EDU摻入實驗取處對數(shù)生長期細胞，均勻接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，根據(jù)EDU檢測試劑盒說明書處理細胞，流式細胞儀分析。檢測細胞分為CD133+的PC-3細胞組和CD133-的PC-3細胞組。細胞克隆形成實驗采用5.6%的低熔點瓊脂糖溶液，高壓滅菌后備用。使用培養(yǎng)基稀釋5.6%低熔點瓊脂糖溶液至0.7%低熔點瓊脂糖溶液，加入6孔細胞培養(yǎng)板中，冷卻凝固。消化重懸細胞，與等量0.7%低熔點瓊脂糖溶液混合，配制成0.35%低熔點瓊脂糖細胞懸液，加入6孔細胞培養(yǎng)板中，500個細胞/孔，靜置凝固，5% CO2、37 ℃細胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。檢測的細胞分為CD133+的PC-3細胞組和CD133-的PC-3細胞組；干涉Lmo4的PC-3/SiLmo4細胞組和對照組PC-3/Control細胞組。

1.2.8免疫共沉淀實驗(Co-immunoprecipitation,Co-IP) 取生長狀態(tài)良好的細胞，RIPA裂解液裂解。加入瓊脂糖珠預處理，4 ℃孵育1 h，離心丟棄瓊脂糖珠。加入一抗4 ℃孵育過夜，加入瓊脂糖珠4 ℃孵育4 h，離心回收瓊脂糖珠，加入RIPA裂解液和5×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱，離心收集含有蛋白的上清液。

1.2.9細胞免疫熒光實驗 取生長狀態(tài)良好的細胞，4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100透化劑透化，加入3%馬血清封閉。一抗4 ℃孵育過夜，使用帶熒光標記Alexa Flour 647的二抗4 ℃孵育2 h，室溫染核，熒光顯微鏡拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察前列腺癌組織結(jié)構(gòu)變化為觀察前列腺癌組織結(jié)構(gòu)變化，將病理科收集的前列腺增生組織和前列腺癌組織進行HE染色。鏡下可見前列腺增生組織中細胞分化良好，腺體結(jié)構(gòu)完整。而在前列腺癌組織中，發(fā)現(xiàn)腺體與腺體之間的距離減小，同時伴有腺體形狀和大小的改變，正常的腺體結(jié)構(gòu)缺失。腺體周圍的基質(zhì)受到癌細胞的浸潤而形成相互融合的腺體。同時可見由惡性上皮細胞或不規(guī)則浸潤性腫塊所形成的索和鏈狀結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 前列腺增生及前列腺癌組織切片的HE染色 ×200

2.2 IHC檢測CD133和LMO4的組織表達水平為分析前列腺癌組織中CD133和LMO4的蛋白表達水平，利用IHC檢測7例前列腺增生組織標本和10例前列腺癌組織標本。結(jié)果顯示：8例前列腺癌組織中CD133表達明顯升高，8例LMO4蛋白表達明顯升高。提示CD133與LMO4的表達與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)(圖2)。對前列腺癌及前列腺增生組織的IHC結(jié)果進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)LMO4與CD133的蛋白表達具有一致性(表2)。

表2 CD133和LMO4在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達分析[n(%)]

2.3 CD133+細胞克隆形成能力增強為了分析CD133對前列腺癌細胞增殖能力的影響，以人前列腺癌細胞系PC-3為研究對象，利用流式細胞分選技術(shù)在PC-3細胞中分選出CD133+和CD133-細胞，分別進行細胞克隆實驗。結(jié)果顯示CD133-細胞克隆形成率低于CD133+細胞克隆形成率，二者差異有統(tǒng)計學意義(t=11.34，P=0.000)(圖3)。在人前列腺癌細胞系PC-3中，與CD133-細胞相比，CD133+細胞具有較強的克隆形成能力。

2.4 LMO4影響CD133的表達為研究LMO4的表達變化是否影響CD133的表達，利用人前列腺癌細胞系PC-3建立穩(wěn)定干涉Lmo4的細胞株P(guān)C-3/SiLmo4降低LMO4的表達水平。Western blot結(jié)果顯示：在干涉Lmo4的前列腺癌細胞株P(guān)C-3中，CD133的表達明顯降低(圖4A)。同時利用細胞免疫技術(shù)檢測前列腺癌細胞PC-3和Lmo4干涉的細胞PC-3/SiLmo4中CD133表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在干涉Lmo4后，PC-3細胞中CD133+細胞明顯減少(圖4B)。

圖2 IHC檢測前列腺癌和前列腺增生

圖3 前列腺癌細胞形成單細胞克隆分析

A： PC-3細胞中CD133+細胞克隆形態(tài)圖，右側(cè)為左側(cè)黃色方框內(nèi)放大圖； B： PC-3細胞中CD133+細胞克隆形成率分析圖；與CD133-細胞比較：***P<0.001

進一步利用流式細胞分析技術(shù)檢測PC-3細胞中CD133+細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC-3細胞中CD133+細胞數(shù)比例較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.79，P=0.04)(圖5)。提示LMO4的表達變化影響干性標記分子CD133的表達。

2.5 LMO4影響前列腺癌細胞的增殖為觀察LMO4的表達變化對PC-3細胞增殖的影響，采用EDU摻入實驗檢測細胞增殖效率。結(jié)果顯示前列腺癌細胞PC-3增殖率較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.31，P=0.03)(圖6A)。利用細胞克隆形成實驗觀察PC-3細胞的克隆效率，結(jié)果顯示干涉Lmo4的前列腺癌細胞PC/SiLmo4克隆形成率與對照組相比較低，差異有統(tǒng)計學意義(t=22.65，P=0.000)(圖6B)。而穩(wěn)定干涉Lmo4的PC-3細胞中，通過流式細胞分選中獲得的CD133+細胞，未見單細胞克隆的形成。

圖4 穩(wěn)定干涉Lmo4的PC-3細胞中LMO4與CD133的表達

A：Western blot檢測干涉Lmo4的PC-3細胞中LMO4和CD133表達； 1： PC-3; 2： PC-3/Control; 3： PC-3/SiLmo4；B：細胞免疫實驗檢測干涉Lmo4的PC-3細胞中LMO4和CD133表達 ×200

圖5 流式細胞分析PC-3/SiLmo4細胞中CD133+細胞比例變化

A：PC-3/Control細胞；B:PC-3/SiLmo4細胞；C:PC-3/SiLmo4細胞中CD133+細胞比例柱狀圖；與PC-3/Control細胞比較：*P<0.05

2.6 LMO4與CDK9形成復合體調(diào)節(jié)前列腺癌細胞的增殖為了研究LMO4與CDK9形成的復合體是否影響前列腺細胞的生物學行為，將含有人LMO4 cDNA表達載體(GV320)的慢病毒感染正常前列腺細胞PET2-TGC，建立基因修飾細胞株P(guān)ET2-TGC/LMO4，以過量表達帶有Flag標簽的LMO4。依靠Flag標簽利用Co-IP技術(shù)捕獲Flag-LMO4s融合蛋白，并進行Western blot檢測。結(jié)果證實：在正常前列腺細胞PET2-TGC中，LMO4能夠與CDK9結(jié)合形成復合體；但在過量表達LMO4的PET2-TGC細胞中，沒有檢測到LMO4結(jié)合的CDK9(圖7A)。同時利用前列腺癌細胞系PC-3和干涉Lmo4的前列腺癌細胞PC-3/SiLmo4為研究對象，運用Co-IP技術(shù)捕獲目的蛋白CDK9，Western blot結(jié)果顯示在前列腺癌細胞系PC-3和前列腺癌Lmo4干涉細胞系PC-3/SiLmo4中，均沒有檢測到LMO4(圖7B)。提示在前列腺癌細胞中沒有形成LMO4/CDK9復合體。

3 討論

前列腺癌是常見的上皮性惡性腫瘤之一，CD133+前列腺癌細胞展現(xiàn)出干性特征，而對于前列腺癌干細胞的來源和標記分子目前存在較大爭議[12-13]。從前列腺癌細胞系中分離出CD133+細胞進行細胞生物行為學研究發(fā)現(xiàn)，CD133+的前列腺癌細胞比CD133-細胞增殖快[14]。使用前列腺癌化學治療藥多西他賽和γ射線處理過后，CD133+細胞的克隆形成率仍保持較高水平，由此提示CD133+細胞表現(xiàn)出了腫瘤干細胞的行為和特點，在前列腺癌中CD133的表達受哪些基因和蛋白調(diào)控仍待解決。

圖6 干涉LMO4表達水平對前列腺癌細胞增殖的影響

A：EDU摻入實驗檢測LMO4表達水平對前列腺癌細胞增殖的影響；與PC-3/Control比較：*P<0.05；B：前列腺癌細胞形成單細胞克隆分析，PC-3干涉Lmo4后克隆形成率的變化，右側(cè)為左側(cè)黃色方框內(nèi)放大圖片；與PC-3/Control比較：***P<0.001

圖7 Co-IP檢測PET2-TGC和PC-3細胞中LMO4與CDK9相互作用

A：Co-IP分析正常前列腺細胞PET2-TGC(Con)及過量表達LMO4的PET2-TGC(LMO4)細胞中CDK9/LMO4復合體；B：Co-IP分析前列腺癌細胞PC-3(Con)及穩(wěn)定干涉Lmo4的PC-3細胞(SiLmo4)中CDK9/LMO4復合體

LMO4作為核轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮“橋”分子的作用募集其他核心轉(zhuǎn)錄因子而形成復合體，調(diào)控目的基因表達。有研究[9-10]表明，在如乳腺癌、非小細胞型肺癌、結(jié)腸癌、口腔上皮鱗癌等多種腫瘤組織中，LMO4的表達水平顯著增加。為了觀察LMO4在前列腺癌組織中表達及其與CD133蛋白表達的關(guān)系，利用免疫組織化學方法檢測LMO4和CD133的表達水平。結(jié)果表明70%的前列腺癌組織顯示CD133+/LMO4+，提示LMO4可能與CD133表達相關(guān)且具有一致性。利用流式分選技術(shù)在PC-3細胞中分選獲得CD133+和CD133-細胞，分別進行細胞克隆形成實驗，結(jié)果表明CD133+細胞克隆形成率較CD133-細胞明顯增高。進一步運用RNA干涉技術(shù)干涉人前列腺癌細胞PC-3中Lmo4的表達，并建立穩(wěn)定干涉Lmo4的細胞株。免疫印跡技術(shù)、流式細胞術(shù)和細胞免疫熒光均證實降低LMO4的表達水平，可導致PC-3細胞中CD133的表達水平及CD133+細胞的數(shù)量均明顯降低，表明CD133的表達可能受到LMO4的調(diào)控。此外，單細胞克隆形成實驗中，穩(wěn)定干涉Lmo4的PC-3細胞在流式細胞分選中獲得的CD133+細胞不能形成單細胞克隆，這可能由于干涉Lmo4后導致CD133+細胞過少有關(guān)。

以往研究[10]表明LMO4在腫瘤形成過程中影響細胞增殖。EDU摻入實驗和細胞克隆形成實驗均證實減少LMO4的表達明顯抑制PC-3細胞增殖。因此，在前列腺癌細胞異常增殖過程中，LMO4的表達變化影響前列腺癌細胞增殖速度。因此在前列腺癌細胞中LMO4可能參與調(diào)控CD133的表達。

有研究[14]證實核轉(zhuǎn)錄因子LMO4在造血干細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮重要的作用。LMO4與 LIM結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白LDB-1及周期蛋白依賴性激酶CDK9等形成動態(tài)的復合體調(diào)節(jié)紅細胞分化。CDK9參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄延伸、分化和凋亡等多種信號通路，如CDK9調(diào)節(jié)細胞周期和RNA聚合酶的磷酸化，進而調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化等生物學行為[15]。Co-IP結(jié)果證實在正常前列腺細胞中存在LMO4與CDK9的相互作用，而過量表達LMO4后，未檢測到與外源性LMO4結(jié)合的CDK9，其機制可能與過量表達LMO4而改變內(nèi)源性的LMO4/CDK9復合體平衡狀態(tài)有關(guān)。由于缺乏用于免疫共沉淀抗LMO4商業(yè)化抗體，未能檢測PC-3細胞中內(nèi)源性的LMO4/CDK9復合體變化。而利用CDK9抗體捕獲CDK9來檢測CDK9結(jié)合的LMO4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在人前列腺癌細胞或穩(wěn)定干涉LMO4的前列腺癌細胞系，均未檢測到LMO4/CDK9復合體。由此提示，LMO4在參與調(diào)節(jié)前列腺癌細胞的增殖過程中，可能不依賴于LMO4與CDK9結(jié)合的蛋白復合體，其調(diào)控的分子機制有待進一步研究。