左歸飲對(duì)腎陰虛衰老大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

何 帆，江 婷，洪世忠,4，陳衛(wèi)東，劉 李,5

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝研究所，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，安徽 合肥 230012；5.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009)

左歸飲是《景岳全書》中的一首名方，全方由熟地黃、山藥、枸杞子、山茱萸、茯苓和炙甘草組成，具有滋補(bǔ)腎陰、抗自由基、延緩衰老的功效[1-2]。方中熟地黃、山茱萸、枸杞子滋陰益腎養(yǎng)肝，山藥、茯苓、炙甘草健脾以助生化之源，諸藥合用有益腎養(yǎng)肝健脾之功，臨床上應(yīng)用廣泛，對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征[3]、足跟痛[4]、干燥綜合征[5]、眩暈[6]等疾病均有良好療效。抗氧化作為延緩衰老的重要標(biāo)志，被廣泛用于延緩衰老的研究。目前臨床上常用的預(yù)防和治療衰老的藥物大多是通過(guò)破壞衰老細(xì)胞所依賴的保護(hù)機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的，作用機(jī)制較為單一，常常需要聯(lián)合用藥，并且對(duì)衰老的其他體征改善并不明顯。而中藥則因其能從綜合調(diào)理的角度增強(qiáng)人體功能，提高抵抗疾病能力而越來(lái)越受到人們的青睞。有研究[7]證明，左歸飲中含有人體必需的微量元素Fe、Zn、Cu、Mn，對(duì)防治疾病、延緩衰老具有一定作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎陰為元陰、真陰之所在，精、血、津液的衰耗主要表現(xiàn)在腎陰虛方面，因此本研究擬通過(guò)測(cè)定大鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、肌酐(creatinine, Cr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的水平及cAMP/cGMP，探討左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠的延緩衰老作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑 甲狀腺素片(批號(hào)H37021098)：山東仁和制藥有限公司；熟地黃(批號(hào) 161216)、山藥(批號(hào) 161223)、枸杞子(批號(hào) 161017)、山茱萸(批號(hào) 1701161)、茯苓(批號(hào) 160228)、炙甘草(批號(hào)160228)：安徽普仁中藥飲片有限公司。所有藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定。MDA檢測(cè)試劑盒(批號(hào) A003-1)、SOD活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào) A001-3)、GSH-Px測(cè)試盒(批號(hào)20190830)、Cr試劑盒(批號(hào) 20191028)、BUN試劑盒(批號(hào) 20191030)：南京建成生物工程研究所；CAT活性檢測(cè)試劑盒(批號(hào) 20190909)：北京索萊寶科技有限公司；大鼠cAMP和cGMP ELISA法檢測(cè)試劑盒(批號(hào) 201907)：泉州市睿信生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 5810R離心機(jī)：德國(guó)eppendorf股份公司；AB135-S精密分析天平：瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；Spectra Max M5多功酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；艾科浦超純水系統(tǒng)：重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 動(dòng)物 30只SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2015-002，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃，濕度(50±10)%。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物的制備 按照《景岳全書》記載，稱取熟地黃9 g，山藥、枸杞子各6 g，炙甘草3 g，茯苓4 g，山茱萸5 g，按照傳統(tǒng)煎煮工藝，藥材加10倍水浸泡30 min，煮沸后計(jì)時(shí)，文火煎30 min，然后將藥液倒出，藥渣再加6倍量水煮沸20 min后將藥液倒出，合并2次濾液，并用4層紗布過(guò)濾，濃縮至生藥量為1.5 g/mL。

2.2 分組與給藥 將30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組，模型組，左歸飲高、中、低劑量組，每組6只。正常組給予生理鹽水，劑量為10 mL/kg，模型組用甲狀腺素片配制成10 mg/mL混懸液灌胃，劑量為150 mg/kg，連續(xù)7 d，復(fù)制大鼠腎陰虛模型[8]。左歸飲高、中、低劑量組每日清晨灌胃給予左歸飲水提液，高劑量組為31 g/kg，中劑量組為20.67 g/kg，低劑量組為13.78 g/kg，連續(xù)7 d。末次給藥后，采用腹主動(dòng)脈取血，室溫下靜置1 h后離心，得左歸飲含藥血清，于-20 ℃條件下貯存。

3 結(jié)果

3.1 左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠血清cAMP、cGMP及其比值的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清cAMP水平與cAMP/cGMP均顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，左歸飲高、中、低劑量組大鼠血清cAMP水平均顯著降低(P<0.05)，cGMP水平無(wú)顯著變化。見(jiàn)表1。

表1 左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠cAMP、cGMP及其比值的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.2 左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠血清SOD、MDA、CAT、GSH-Px水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px水平均顯著下降(P<0.05)，MDA水平顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，左歸飲中、高劑量組大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)，MDA水平顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠血清SOD、MDA、CAT和GSH-Px的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與左歸飲低劑量組比較，#P<0.05；與左歸飲中劑量組比較，◇P<0.05

3.3 左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠血清Cr和BUN水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清Cr和BUN水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，左歸飲低、中、高劑量組大鼠血清Cr和BUN水平均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 左歸飲對(duì)腎陰虛大鼠血清Cr和BUN的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與左歸飲低劑量組比較，#P<0.05；與左歸飲中劑量組比較，◇P<0.05

4 討論

cAMP和cGMP作為一對(duì)細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，廣泛存在于動(dòng)物和微生物細(xì)胞中。研究[9]發(fā)現(xiàn)，腎陰虛患者會(huì)表現(xiàn)為基礎(chǔ)代謝旺盛，體溫升高，體質(zhì)量下降等。另有研究[10]表明，陰虛患者表現(xiàn)為cAMP水平升高，同時(shí)cAMP/cGMP也顯著升高。臨床研究表明，腎陰虛患者除了表現(xiàn)出一般的陰虛癥狀外，同時(shí)還伴有血清Cr水平的升高。本研究中，模型組大鼠血清cAMP/cGMP以及Cr水平與正常組比較均顯著升高，表明模型復(fù)制成功。在左歸飲干預(yù)后，大鼠血清cAMP水平以及cAMP/cGMP均顯著下降，提示左歸飲對(duì)改善腎陰虛也有一定的作用。

目前，衰老的確切原因尚不明確。西醫(yī)認(rèn)為，衰老是一個(gè)由累積的損傷引起的退化過(guò)程，其導(dǎo)致了細(xì)胞功能障礙、組織的衰竭和死亡[11]。因此，線粒體自由基老化理論在近幾十年中一直處于衰老理論的中心地位。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎虛與衰老密切相關(guān)，其中，腎虛衰老學(xué)說(shuō)占有重要地位。張景岳稱腎之根本為命門，腎中陰陽(yáng)相互制約、相互依存，維持人體生理的動(dòng)態(tài)平衡。因此，人體的衰老與腎中精氣密切相關(guān)[12]。而左歸飲主要用于治療真陰虛而火不旺之證，方中用熟地黃、山茱萸、枸杞子補(bǔ)益肝腎，以山藥、茯苓、炙甘草益氣健脾，因此多年來(lái)用于老年性疾病的治療[13]。左歸飲治療腎陰虛可能與延緩衰老作用有著密切聯(lián)系。本研究通過(guò)檢測(cè)SOD、GSH-Px、MDA等抗氧化指標(biāo)，探究左歸飲延緩腎陰虛衰老的機(jī)制。SOD和GSH-Px作為生物體系中抗氧化酶系的重要成員，在清除自由基方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。MDA作為活性氧與多不飽和脂肪酸反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量能反映體內(nèi)自由基的多少，從而間接推斷自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度[14]，因此MDA含量的增加也是導(dǎo)致衰老的重要原因[15]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，左歸飲中、高劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)，MDA水平明顯下降(P<0.05)。這進(jìn)一步提示左歸飲可以通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠血清SOD、GSH-Px和MDA水平從而起到抗氧化延緩衰老的作用。此外，CAT在抗氧化系統(tǒng)中同樣具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，左歸飲低、中、高劑量組大鼠血清CAT水平均明顯升高，表明左歸飲可以通過(guò)增加H2O2分解，以生成活性氧和水來(lái)使細(xì)胞免受H2O2的毒害。綜上所述，模型組大鼠血清各項(xiàng)延緩衰老指標(biāo)與左歸飲低、中、高劑量組均有顯著性差異，表明腎陰虛可能是導(dǎo)致衰老的重要原因，而左歸飲在治療腎陰虛方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

此外，Cr和BUN作為評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)，其水平的高低也間接影響著人體的延緩衰老作用。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，中藥天年飲可顯著降低衰老大鼠Cr和BUN水平，從而起到改善大鼠腎功能的作用，而本研究從反向證實(shí)了這一結(jié)論，左歸飲顯著降低了腎陰虛大鼠的Cr和BUN水平，通過(guò)改善腎功能而達(dá)到延緩衰老的作用。