丹皮酚對動脈粥樣硬化相關(guān)細胞的作用及機制

孫 穎，劉雅蓉，吳鴻飛，2，戴 敏，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病中的重要病程，嚴重影響人們的身體健康。臨床研究表明，導致AS的危險因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖、高纖維蛋白原血癥等[1]。AS發(fā)生過程中的病理變化主要有脂質(zhì)積累導致的血管堵塞，內(nèi)皮細胞受損導致的內(nèi)皮細胞功能障礙，血流低切應力造成的內(nèi)皮功能的進一步紊亂，以及炎癥反應導致的血管病變等。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對實驗性AS的治療作用顯著，尤其是在降低脂質(zhì)以及抑制炎癥反應方面效果明顯，同時在改善內(nèi)皮功能障礙及抗氧化等方面也有較好的作用。現(xiàn)對丹皮酚對實驗性AS的預防及治療作用，以及丹皮酚對AS發(fā)生的相關(guān)細胞的作用與機制進行綜述。

1 AS的病理機制及其相關(guān)細胞

AS是現(xiàn)代社會危害人類身體健康的主要疾病之一，損害累及機體的重要器官，主要是心腦血管系統(tǒng)。其病因病機復雜，主要有脂質(zhì)浸潤學說、內(nèi)膜損傷學說以及炎癥學說[3]。深入研究后發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及單核巨噬細胞在AS的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。

1.1 血管內(nèi)皮細胞在AS中的作用 血管內(nèi)皮細胞是血管最外層的屏障。當危害血管的外界刺激如高血脂、血流低切應力等對血管內(nèi)皮細胞造成損傷后，會導致內(nèi)皮細胞功能障礙，異常分泌細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)及血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)等一系列黏附分子或白細胞介素，使得在血液中游離的單核細胞易于黏附在內(nèi)皮細胞表面，并分化成為巨噬細胞，進而釋放單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)等導致更多的單核巨噬細胞聚集，逐漸形成AS的斑塊。內(nèi)皮細胞炎癥也是導致AS發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。炎癥因子的升高標志著炎癥反應的加劇，不斷促進斑塊的形成。內(nèi)皮細胞功能障礙還會引起血管收縮及擴張因子的分泌改變，導致內(nèi)皮依賴性血管舒張障礙[4]。

1.2 血管平滑肌細胞在AS中的作用 平滑肌細胞表型的轉(zhuǎn)變及異常增殖是影響AS發(fā)展的突出表現(xiàn)[5]。當平滑肌細胞被生長因子等外在條件激活后由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇蚚6]。同時血管平滑肌細胞開始過度增殖，造成平滑肌增厚及管腔狹窄，合成表型使得異常增殖的血管平滑肌細胞的遷移更易進行。隨著炎癥的進一步加劇，平滑肌細胞會釋放基質(zhì)金屬蛋白酶等細胞因子，溶解初步形成的動脈粥樣斑塊，形成易損斑塊，造成AS的進一步發(fā)展。

1.3 單核-巨噬細胞在AS中的作用 單核-巨噬細胞參與了AS發(fā)展的全過程[7]。巨噬細胞可以隨血液移行與各個細胞產(chǎn)生相互聯(lián)系[8-9]。由于巨噬細胞具有異質(zhì)性和多樣性，在炎癥反應發(fā)生后會由原型向M1型轉(zhuǎn)變[10]，隨后吞噬受損處聚集的脂質(zhì)，進入內(nèi)膜下，形成泡沫細胞。變異壞死的泡沫細胞和部分脂質(zhì)釋放至胞外，形成粥樣斑塊的脂質(zhì)核心。泡沫細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，參與纖維帽金屬膠原纖維的降解，加劇了斑塊的不穩(wěn)定性；同時M1型巨噬細胞會繼續(xù)分泌更多的炎癥因子，使得AS的進一步加劇[11]。除此之外，進展期中的巨噬細胞自噬能力下降，促進斑塊壞死，促使大多數(shù)的細胞凋亡及炎癥應答反應的產(chǎn)生。

2 丹皮酚的主要藥理活性及抗AS作用

牡丹皮是毛茛科植物牡丹的根皮，具有清熱涼血、活血化瘀的功效。丹皮酚是牡丹皮中主要活性成分之一，其化學結(jié)構(gòu)為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮。實驗結(jié)果證實，丹皮酚可以降低AS模型動物血脂，使主動脈內(nèi)膜趨向光滑，并使斑塊厚度變薄，脂質(zhì)條紋減少[12]，丹皮酚還能降低氧化低密度脂蛋白(oxidation low density lipoprotein，ox-LDL)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平及提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力發(fā)揮抗氧化作用[13]，以及改善血管內(nèi)的炎癥反應等[14]。因此認為丹皮酚具有良好的抗AS的效果。近年來丹皮酚抗AS的機制研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)丹皮酚對AS相關(guān)細胞有顯著作用。

2.1 丹皮酚通過抑制血管內(nèi)皮細胞炎癥反應抗AS

2.1.1 丹皮酚提高內(nèi)皮細胞存活率 內(nèi)皮功能障礙是AS的始動因素，丹皮酚對損傷的內(nèi)皮細胞具有保護作用。首先在改善細胞損傷方面，細胞受到脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或ox-LDL刺激時，丹皮酚組的內(nèi)皮細胞形態(tài)變化最小。研究[15]發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)增多，而丹皮酚可以抑制LDH的產(chǎn)生，進而改善細胞的通透性，明顯提高內(nèi)皮細胞存活率。

2.1.2 丹皮酚抑制炎癥因子的分泌 研究[16]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚與miRNA-21抑制劑均可抑制炎癥因子的釋放，且兩者共同作用后效果增強，說明丹皮酚是通過降低miRNA-21的水平起到對內(nèi)皮細胞的保護作用。進一步的研究[16]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚還下調(diào)了p38絲裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)信號通路相關(guān)蛋白的表達，從而說明丹皮酚可通過降低miRNA-21的水平進而抑制p38-MAPK信號通路的活化起到減少炎癥因子的分泌實現(xiàn)抗炎作用。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可使磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine- threonine kinase，AKT)通路中經(jīng)誘導后的蛋白磷酸化作用降低，從而抑制其下游的信號通路，下調(diào)炎癥反應程度起到保護內(nèi)皮細胞的作用。

2.1.3 丹皮酚改善血管內(nèi)皮細胞的黏附功能 丹皮酚可以直接減少ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的異常表達，降低其他細胞向內(nèi)皮細胞的異常黏附。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-126參與了內(nèi)皮細胞的損傷及修復過程，證明了VCAM-1是miRNA-126的特異性調(diào)控基因，丹皮酚通過上調(diào)miRNA-126的水平，降低大鼠單核細胞對血管內(nèi)皮細胞的黏附性。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚會抑制Toll樣受體4(Toll like receptor，TLR-4)受體及核因子κB(nuclear factor-κappaB，NF-κB)基因的表達及激活，并可顯著下調(diào)由LPS導致的TLR-4受體及下游NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達水平，降低黏附分子的表達，改善細胞的黏附功能。也有研究人員采用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor -α，TNF-α)作為刺激劑，加強了單核細胞向內(nèi)皮細胞的黏附，導致ICAM-1的表達增多；丹皮酚則可以抑制ICAM-1的表達，改善內(nèi)皮細胞黏附異常。進一步的研究[19]發(fā)現(xiàn)，ICAM-1的過度表達可能與NF-κB信號通路及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化有關(guān)，丹皮酚可以抑制NF-κB p65易位入核和抑制因子B(I κBα)的磷酸化；同時也阻斷了TNF-α誘導的p38和ERK的磷酸化，從而抑制了ICAM-1的表達。

2.1.4 丹皮酚調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的自噬和凋亡 有研究[20]發(fā)現(xiàn)，以丹酚酸B配伍丹皮酚配伍的含藥血清可以使得Bcl-2表達量升高，Bax表達量降低，表明丹皮酚可能通過抑制血管內(nèi)皮細胞凋亡的方式來保護內(nèi)皮細胞。另有研究[21]發(fā)現(xiàn)，ox-LDL引起血管內(nèi)皮細胞的自噬產(chǎn)生，而丹皮酚可以減弱自噬；研究還證明了在血管內(nèi)皮細胞中，Beclin-1是miR-30a的靶基因，Beclin-1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubules associated protein light chain 3，LC3Ⅱ)蛋白的表達也受到miR-30a的調(diào)控，miR-30a表達增多時，Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白的表達都受到抑制。丹皮酚的治療可以上調(diào)miR-30a的表達，從而抑制自噬相關(guān)基因蛋白的表達，減弱血管內(nèi)皮細胞的自噬。

2.1.5 丹皮酚抑制血管內(nèi)皮細胞的早衰 內(nèi)皮細胞早衰會對內(nèi)皮細胞的生長以及抗氧化作用產(chǎn)生消極影響。有研究[22]用H2O2刺激細胞，造成內(nèi)皮細胞早衰的模型，發(fā)現(xiàn)丹皮酚預處理可以直接減少刺激劑導致的衰老細胞的數(shù)量，改善H2O2導致的內(nèi)皮細胞生長停滯，使其不再長期處于G0/G1期，恢復細胞增殖的活力；丹皮酚還可下調(diào)內(nèi)皮細胞p53的過度表達，并且抑制了組蛋白H3、H4的乙?；?，從而使得Sirt1蛋白的表達降低。

2.2 丹皮酚通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞功能抗AS

2.2.1 丹皮酚抑制血管平滑肌細胞過度增殖 丹皮酚可以抑制TNF-α誘導的血管平滑肌細胞異常增殖和遷移以及后續(xù)的炎癥反應。丹皮酚可明顯降低增殖細胞核抗原的表達；另一方面，丹皮酚可抑制TNF-α誘導的血管平滑肌細胞的增殖和降低TNF-α刺激產(chǎn)生的炎癥因子，如IL-1β和IL-6的水平[23]。由丹皮酚會增大G0/G1期比例而縮小S期的比例，推測丹皮酚可阻止增殖的血管平滑肌細胞從G0/G1期進入S期，從而改善血管平滑肌細胞的異常增殖。進一步研究[24]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚的這種作用可能與Ras-Raf-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Ras-Raf-extracellular regulated protein kinases1/2，Ras-Raf-ERK1/2)信號傳導途徑有關(guān)。通路抑制劑組與丹皮酚組的細胞存活率是相類似的；低氧狀態(tài)下有更多細胞從G0/G1期進入S期和G2/M期。丹皮酚或通路抑制劑U0126單獨處理后，進展至細胞周期S期和G2/M期的大鼠肺動脈平滑肌細胞數(shù)量減少，說明丹皮酚抑制平滑肌細胞增殖以及改善細胞周期進程的作用機制是與ERK1/2有關(guān)的。實驗研究[25-26]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以阻斷內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中血管平滑肌細胞的過度增殖，升高內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS )mRNA的表達，降低c-fos mRNA的表達，并且通過抑制血小板源性生長因子(platelet derived growth factor-B，PDGF-B)及VEGF的表達阻斷Ras-Raf-ERK信號轉(zhuǎn)導途徑，從而對平滑肌細胞起到保護作用。

2.2.2 丹皮酚誘導血管平滑肌細胞的凋亡 有研究[27]用丹皮酚干預平滑肌細胞，再將細胞與TNF-α共孵育后發(fā)現(xiàn)Bax上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，此結(jié)果說明丹皮酚可能通過誘導凋亡的方式抑制平滑肌細胞的過度增殖。以丹皮酚干預共培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞所分泌的TNF-α隨丹皮酚濃度的增多而減少，血管平滑肌細胞表達的p53和活化的caspase-3水平下降，同時抑制p38MAPK信號通路的蛋白表達，說明丹皮酚可通過抑制共培養(yǎng)系統(tǒng)中內(nèi)皮細胞內(nèi)TNF-α分泌，抑制血管平滑肌細胞中p38 MAPK信號通路，降低凋亡相關(guān)蛋白水平，進而抑制血管平滑肌細胞的凋亡[28]。

2.2.3 丹皮酚調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的自噬 有研究[29]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在改善血管平滑肌細胞過度增殖的同時可以增加自噬標志蛋白LC3的表達，促進自噬，這種作用是在激活了AMP依賴的蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路后實現(xiàn)的。

2.3 丹皮酚通過調(diào)控巨噬細胞功能抗AS

2.3.1 丹皮酚減少巨噬細胞吞噬脂質(zhì) 泡沫細胞聚集于AS損傷部位是早期AS的標志。而泡沫細胞正是由巨噬細胞吞噬脂質(zhì)而形成的。用ox-LDL刺激巨噬細胞油紅染色后發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能明顯減少紅色油滴產(chǎn)生，并下調(diào)清道夫受體A(scavenger receptor A，SR-A) mRNA水平，結(jié)果提示丹皮酚可能通過下調(diào)SR-A mRNA減少攝取ox-LDL。另有實驗結(jié)果[30]提示，丹皮酚可能是通過增加巨噬細胞血紅素加氧酶-1(heme oxygenase1，HO-1)蛋白表達，及影響C-Jun/CD36通路來減少巨噬細胞對ox-LDL的攝取。

2.3.2 丹皮酚促進巨噬細胞外排膽固醇 有實驗研究[31]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可能通過增加巨噬細胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)蛋白的表達，促進巨噬細胞外排膽固醇。進一步的研究[32]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚通過促進肝X受體α/類視黃醇X受體α(liver X receptor α/retinoid X receptor α，LXRα/RXRα)的活化，增強ABCA1蛋白表達，使得巨噬細胞內(nèi)膽固醇流出增多，從而減輕泡沫細胞的形成，達到抗AS的作用。

2.3.3 丹皮酚抑制巨噬細胞分泌炎癥因子 丹皮酚可降低由晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein product，AOPP)誘導的巨噬細胞炎癥因子及iNOS的基因表達水平，促進晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和CD36蛋白水平的升高，由此認為丹皮酚的抗氧化應激的作用可能是激活RAGE和CD36介導的信號通路，降低炎癥因子的表達[33]。丹皮酚還可呈劑量依賴性地抑制LPS誘導的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、ERK1/2、p38 MAPKs的磷酸化。研究結(jié)果說明，丹皮酚是通過抑制NF-κB通路及MAPK信號傳導，抑制炎癥因子產(chǎn)生，提高細胞活率[34]。

3 丹皮酚對細胞間相互作用的影響

3.1 丹皮酚對血管內(nèi)皮細胞與血管平滑肌細胞相互作用的影響 有研究[35]將血管平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)以LPS刺激血管平滑肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹皮酚可劑量依賴性地改善血管內(nèi)皮細胞的細胞損傷，降低炎癥因子及黏附分子的產(chǎn)生，改善血管內(nèi)皮細胞的異常黏附功能。其作用機制為丹皮酚降低PI3K/AKT磷酸化，減少p65入核以抑制下游通路的傳導，改善內(nèi)皮細胞損傷。用LPS對血管內(nèi)皮細胞進行刺激，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可以抑制TNF-α的分泌，同時抑制共培養(yǎng)體系中血管平滑肌細胞的凋亡。進一步研究[28]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚可以劑量依賴性地抑制p38 MAPK通路及凋亡蛋白的激活。這說明丹皮酚可能通過抑制p38 MAPK信號通路的激活，進而抑制血管平滑肌細胞的凋亡，達到對血管平滑肌細胞的保護作用，達到抗AS的目的。

3.2 丹皮酚對血管內(nèi)皮細胞與單核細胞相互作用的影響 外泌體是由細胞分泌的一種囊泡樣物質(zhì)，其中包含了許多如miRNA、mRNA信息，能實現(xiàn)細胞間的信息交流和相互作用[36]。研究人員將血管內(nèi)皮細胞與單核細胞共培養(yǎng)，以LPS誘導單核細胞炎癥反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹皮酚組單核細胞所分泌出的外泌體中miR-223顯著上升，同時其下游的STAT3信號通路被抑制，內(nèi)皮細胞的黏附功能隨之得到改善。實驗證實丹皮酚可能通過上調(diào)THP-1細胞外泌體中miR-223的表達，抑制下游STAT3的信號通路，從而抑制內(nèi)皮黏附作用，改善內(nèi)皮細胞炎癥反應[37]。

4 結(jié)語

AS作為一種形成機制復雜、病程發(fā)展漫長的慢性炎癥性疾病，得到了越來越多的關(guān)注和研究。丹皮酚能通過減輕內(nèi)皮細胞炎癥反應，調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞功能及抑制巨噬細胞泡沫化等方面達到對AS的防治作用。影響AS病程的細胞遠不止以上所提到的幾種，還包括樹突狀細胞、中性粒細胞、白細胞等免疫細胞，以及紅細胞等血液細胞，但目前關(guān)于丹皮酚對于這幾類細胞的研究還鮮有報道。同時近年來miRNA也被發(fā)現(xiàn)在AS中起到重要作用，這也為以后研究丹皮酚治療AS的機制提供了更多可研究的思路。