自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的研究

解駿 李少華 凌蕓

摘要：目的 探討不同濃度自擬蠲痹補(bǔ)腎方對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)滑膜炎癥的影響機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 Wistar大鼠32只隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（滅菌用水灌胃）、自擬蠲痹補(bǔ)腎方高濃度組、自擬蠲痹補(bǔ)腎方低濃度組，雷公藤多苷片組。通過研究高低二個(gè)不同劑量的自擬蠲痹補(bǔ)腎方對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者滑膜成纖維細(xì)胞的影響，探討其可能的作用機(jī)制。結(jié)果 與空白對(duì)照血清相比，自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細(xì)胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)（P<0.0001）。結(jié)論 自擬蠲痹補(bǔ)腎方可能是通過調(diào)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)，抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;滑膜炎癥;成纖維細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R593.22 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號(hào)：1007-2349（2020）02-0068-04

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA），在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率在1～3%左右，以慢性起病，最終累及全身多個(gè)系統(tǒng)的自身免疫性的病患，在我國，大約有四五百萬人受RA 的困擾，報(bào)道的致殘率可高達(dá)50%[1-2]。RA在起病的最初2-3年內(nèi)會(huì)發(fā)生不可逆的關(guān)節(jié)周圍的骨丟失，進(jìn)而致關(guān)節(jié)毀損和全身性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。RA的臨床表現(xiàn)為慢性、進(jìn)行性及對(duì)稱性四肢多關(guān)節(jié)的炎癥，隨著疾病的發(fā)展，會(huì)引起全身多個(gè)系統(tǒng)的損傷。RA關(guān)節(jié)內(nèi)的病理特征表現(xiàn)是慢性增生性炎癥和血管翳的形成，并破壞軟骨面、軟骨下骨的骨質(zhì)，以及關(guān)節(jié)周圍的軟組織等，因此會(huì)造成關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)的毀損，最終的臨床轉(zhuǎn)歸是關(guān)節(jié)功能喪失、外觀畸形以及關(guān)節(jié)局部和全身性骨量的丟失。目前公認(rèn)RA的這些病理變化均與滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡不足密切相關(guān)，而細(xì)胞凋亡不足是大多數(shù)的腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要病因[3]，因此，如果加速滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡可以有效治療RA[4]。本次實(shí)驗(yàn)選用我院自擬蠲痹補(bǔ)腎方作為研究對(duì)象，此方具有活血散瘀、消腫止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的功效，在本院臨床使用多年，得到了廣大醫(yī)生和患者的認(rèn)可。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與滑膜組織 SPF級(jí)的雌性Wistar大鼠32只，體重為（200±10）g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2007 0005，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2008 0050。所有的患者的滑膜組織均來自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬光華醫(yī)院關(guān)節(jié)外科。所有的病例均為女性患者，年齡（53.27±6.11）歲，病程（8±13.85）a，診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥物 自擬蠲痹補(bǔ)腎方（方劑主要為骨碎補(bǔ)、白芍、仙靈脾、豨薟草、補(bǔ)骨脂、青風(fēng)藤、黃芪、絡(luò)石藤）。雷公藤多苷片，規(guī)格：10mg/粒，購自黃石飛云制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20110301。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 32只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照（滅菌用水）組、自擬蠲痹補(bǔ)腎方高濃度組、自擬蠲痹補(bǔ)腎方低濃度組，雷公藤多苷片組。滅菌用水組：滅菌用水3mL/只/天，分2次灌胃。自擬蠲痹補(bǔ)腎方組：主要以美國FDA提出的臨床等效劑量換算公式，以人的使用劑量為標(biāo)準(zhǔn)，得出大鼠的劑量，每只大鼠每天3mL，分兩次灌胃;雷公藤多苷片組3mL灌胃。連續(xù)用藥3天后，在第3天給藥后1 小時(shí)采血。選擇滅菌非抗凝劑的試管中，注射入所采的大鼠血液，室溫等待血液凝結(jié)。將所首先在37℃水溫浴1 小時(shí)，離心15分鐘（轉(zhuǎn)速：3000 轉(zhuǎn)/分鐘）分離血清，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。在使用前，先?6℃恒溫箱內(nèi)30分鐘滅活，然后使用不帶血清的培養(yǎng)基稀釋，過濾后清除細(xì)菌。

1.2.2 原代滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)與傳代 無菌條件下把滑膜組織置于盛有5%FBS DMEM 的15mL離心管中，并于2小時(shí)內(nèi)置入盛有DMEM培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿，清除滑膜組織表面的脂肪組織及血凝塊，清洗3次。將滑膜組織剪碎至1 mm3的小塊置于6 cm2培養(yǎng)皿中，加入4mL DMEM培養(yǎng)液，再加500 μL的Ⅰ型膠原酶（終濃度為3 mg/mL），再次放入37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)消化4小時(shí)后，見絮狀樣的關(guān)節(jié)滑膜組織。用100目的濾網(wǎng)過濾，加PBS沖洗，濾液離心5分鐘（1500轉(zhuǎn)/分），去除上清液。打散細(xì)胞，加入15% FBS DMEM，置10 cm2培養(yǎng)皿中，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)箱，待細(xì)胞密集度大于80%后，消化傳代培養(yǎng)，當(dāng)傳至第三代后，予以胰酶消化待用。

1.2.3 含藥血清對(duì)體外滑膜成纖維細(xì)胞增殖作用的影響 將濃度為2×103個(gè)/mL的第3代成骨細(xì)胞，以100 μL/孔種于96孔培養(yǎng)板，用2%胎牛血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后，分為4組：（1）20%空白血清組;（2）20%自擬蠲痹補(bǔ)腎方高濃度含藥血清組;（3）20%自擬蠲痹補(bǔ)腎方低濃度含藥血清組;（4）20%雷公藤多苷片含藥血清組。每組8孔，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，棄100μl培養(yǎng)液后，每孔加入20μl的噻唑基四唑（MTT）溶液（5 mg/mL），37℃孵育4 h;棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜（DMSO）溶解結(jié)晶，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定吸光值（波長490nm）。計(jì)算方法：細(xì)胞存活率%=（OD試驗(yàn)孔/OD對(duì)照孔）×100%。

1.2.4 含藥血清對(duì)體外滑膜成纖維細(xì)胞的PCNA mRNA、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 （1）取第3代成骨細(xì)胞，予以0.25%胰蛋白酶消化后，反復(fù)吹吸成為單細(xì)胞懸液;細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;吸凈孔板里的培養(yǎng)液，更換為l%胎牛血清培養(yǎng)液饑餓12 h;吸凈孔板里的培養(yǎng)液，再次更換為20%空白對(duì)照血清、20%自擬蠲痹補(bǔ)腎方高濃度含藥血清、20%自擬蠲痹補(bǔ)腎方低濃度含藥血清、20%雷公藤多苷片含藥血清組，每組3孔，再次予以培養(yǎng)24 h;（2）按Trizol法試劑說明書提取滑膜成纖維細(xì)胞RNA，取1μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;（3）引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1;（4）實(shí)時(shí)定量PCR：將熒光染料SYBR Green和目的基因Bcl-2以及內(nèi)參Actin的引物按5μl SYBR Green+0.15μl引物混勻，封膜后，放入實(shí)時(shí)PCR儀（ABI 7900）進(jìn)行PCR反應(yīng)，測(cè)定出PCNA mRNA表達(dá);Bcl-2基因表達(dá)的CT值，根據(jù)公式2-△CT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS（24.0版本）軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布要求，按照均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，如果各治療組方差齊，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較;單獨(dú)2組樣本均數(shù)比較時(shí)，若方差齊，采用t檢驗(yàn)，如果方差不齊，改用t′檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 自擬蠲痹補(bǔ)腎方的含藥血清對(duì)于滑膜成纖維細(xì)胞的作用 如表2所示，與空白對(duì)照組比較，當(dāng)作用時(shí)間在48小時(shí)，5%、10%的自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖均無差別;且不同濃度自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖也未見差別;20%含藥血清作用時(shí)，高濃度的自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清可顯著抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖（P<0.001）。而表3所示，當(dāng)對(duì)比空白對(duì)照組，在20%含藥血清作用時(shí)，高、低濃度自擬蠲痹補(bǔ)腎方及雷公藤多苷片含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖（P<0.0001），但三組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞 PCNA mRNA表達(dá)的影響 如表4所示，對(duì)比空白對(duì)照組，使用20%含藥血清干預(yù)時(shí)，高、低濃度自擬蠲痹補(bǔ)腎方及雷公藤多苷片含藥血清均顯示對(duì)于抑制滑膜成纖維細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)有顯著意義（P<0.0001），但高濃度的自擬蠲痹補(bǔ)腎方比低濃度更具有顯著意義（P=0.037<0.05）。

2.3 含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞 Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 與如表5所示，與空白對(duì)照血清相比，高、低濃度自擬蠲痹補(bǔ)腎方及雷公藤多苷片含藥血清均顯示對(duì)于抑制滑膜成纖維細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)有顯著意義（P<0.0001），三組間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論

自擬蠲痹補(bǔ)腎方可能通過調(diào)節(jié)PCNA與Bcl-2基因的表達(dá)，從而抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖，達(dá)到抑制炎癥與減少骨丟失的目的。

4 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變的關(guān)節(jié)內(nèi)可見滑膜明顯增生，而這些滑膜對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥及關(guān)節(jié)破壞過程中起著重要意義[5-7]。原因在于滑膜成纖維細(xì)胞可能會(huì)分泌各種細(xì)胞因子等產(chǎn)物，如蛋白酶類、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等等，最終這些炎癥因子引起了RA的臨床病理變化。因此，滑膜成纖維細(xì)胞的過度增殖導(dǎo)致的滑膜增生是RA重要的病理特征之一[8-9]。

目前認(rèn)為滑膜細(xì)胞凋亡不足，炎性滑膜細(xì)胞數(shù)目成倍數(shù)的增生，是RA的重要變化。一般正常情況下，人體可以通過增加細(xì)胞凋亡，從而清除這些過多的細(xì)胞而保持動(dòng)態(tài)平衡。但加入滑膜細(xì)胞凋亡不足，就會(huì)可導(dǎo)致滑膜組織增生并進(jìn)而出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞的一系列病理改變，因此RA發(fā)病的主要機(jī)制就是滑膜成纖維細(xì)胞增生過多和凋亡不足。因此目前認(rèn)為治療RA的重要途徑之一，就是抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)增加其凋亡[10-11]。而傳統(tǒng)的植物提取物中，雷公藤紅素[12]、姜黃素等[13]據(jù)報(bào)道可以誘導(dǎo)DNA損傷、細(xì)胞周期阻滯以及凋亡作用，因此其可以抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖，是治療RA重要藥物;但由于具有高毒性以及效果不明確的缺點(diǎn)限制了其使用。而中藥有效成分治療RA具有多靶點(diǎn)、多種途徑的特點(diǎn)，藥理活性比較廣泛，被認(rèn)為有重要的研究價(jià)值;而化學(xué)合成藥及激酶抑制劑類等藥物已經(jīng)通過相關(guān)的臨床研究明確了在治療RA中的治療效果和相對(duì)可靠的安全性，但是其長期用藥的安全性仍有待觀察[14]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）屬于中醫(yī)“痹癥”“歷節(jié)”范疇。古代醫(yī)家一般認(rèn)為風(fēng)寒濕邪外侵是重要的外因。臨床上RA的發(fā)病多為內(nèi)外因相互共同作用的結(jié)果。隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)的持續(xù)進(jìn)步，運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究結(jié)果，闡明了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能發(fā)病機(jī)理?，F(xiàn)代醫(yī)家經(jīng)過繼承發(fā)展，認(rèn)為RA的性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，肝腎脾虛為本，濕滯、瘀阻為標(biāo)。本方扶正逐邪，標(biāo)本兼顧、活血散瘀、消腫止痛，正切中RA本虛標(biāo)實(shí)，肝腎脾虛為本，濕滯、瘀阻為標(biāo)的病機(jī)，是治療痹癥的較好的方劑。

本次實(shí)驗(yàn)主要分析了本院通用的自擬蠲痹補(bǔ)腎方的含藥血清對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖的影響。此次我們的實(shí)驗(yàn)表明：高、低濃度的自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)，且高濃度的自擬蠲痹補(bǔ)腎方比低濃度更顯著。

目前比較公認(rèn)的具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族之一就是Bcl-2基因家族及其相關(guān)蛋白Bcl-2，而目前研究表明它與細(xì)胞凋亡可能有關(guān)的基因之一。Bcl-2是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因，其通過抑制多種形式的細(xì)胞死亡，從而延長了細(xì)胞壽命，增加了細(xì)胞數(shù)目，并且增加遺傳物質(zhì)的突變率。高、低濃度的自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清均能顯著抑制滑膜成纖維細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)。

本次采用中藥血清藥理學(xué)研究方法，通過觀察自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響，我們研究結(jié)果顯示20%自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清的對(duì)于滑膜成纖維細(xì)胞，具有抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)表明高濃度的自擬蠲痹補(bǔ)腎方比低濃度的效果更明確。經(jīng)定量PCR檢驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)：自擬蠲痹補(bǔ)腎方的含藥血清使PCNA與Bcl-2表達(dá)顯著下降，表明它能顯著抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖，顯示了與MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的一致性，這可能是自擬蠲痹補(bǔ)腎方含藥血清能夠下調(diào)滑膜成纖維細(xì)胞增殖可能的作用機(jī)制之一。該研究在細(xì)胞水平及分子水平上為自擬蠲痹補(bǔ)腎方用于臨床RA治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在開發(fā)治療RA的新型中藥復(fù)方中，可考慮多種藥物聯(lián)合應(yīng)用，從細(xì)胞分子水平、基因角度以及治療靶點(diǎn)入手，找出抗RA的高效治療藥物。

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（收稿日期：2019-10-18）