EBUS-TBNA標本檢測熒光定量TB-PCR對縱隔淋巴結(jié)核的診斷價值

張紅軍 楊巧娟 張海濤 蘇 蔚 謝永宏 金發(fā)光 顧 興

超聲支氣管鏡引導(dǎo)下經(jīng)支氣管透壁針吸活檢(endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUS-TBNA)是一項成熟、安全、微創(chuàng)和精準的內(nèi)鏡檢查技術(shù)，已成為縱隔和肺門的占位、腫大淋巴結(jié)等病變診斷的首選方法[1-4]，特別是在全身麻醉技術(shù)應(yīng)用到EBUS-TBNA后，其在臨床上得到了廣泛開展[5-8]。對于縱隔和肺門淋巴結(jié)結(jié)核，尤其是那些以單純肺門及縱隔病變?yōu)橹?，而肺?nèi)又無明顯病灶的淋巴結(jié)結(jié)核患者，通過影像學或血清特異標志物與惡性疾病相鑒別，是極為困難的[9-13]；而且，在縱隔及肺門的良性病變中，最為常見的是淋巴結(jié)結(jié)核和結(jié)節(jié)病，但二者共同的病理學特征均為壞死性肉芽腫性炎，而他們咳嗽、胸痛、胸悶、低熱等呼吸道癥狀也無特異性，因此，通過臨床癥狀、T-SPOT、穿刺液查結(jié)核桿菌DNA及病理活檢等方法很難進行鑒別[14-15]。自2017年1月起，我院成功開展了EBUS-TBNA標本送檢分枝桿菌菌種鑒定(DNA微陣列芯片法)，該方法對淋巴結(jié)結(jié)核和結(jié)節(jié)病，以及肺門淋巴結(jié)結(jié)核和惡性腫瘤的鑒別提供了很大的幫助?，F(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年1月至2018年6月在空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)鏡中心接受EBUS-TBNA的患者65例，其中，男性33例(50.8%)，女性32例(49.2%)；年齡小于等于60歲者35例(53.8%)，年齡大于60歲者30例(46.2%)；惡性腫瘤31例(47.7%)，非惡性腫瘤患者34例(52.3%)。對所有患者的影像學特征，以及血清T-spot、血清腫瘤標志物、病理結(jié)果和熒光定量TB-PCR檢測等資料進行回顧性分析，揭示其規(guī)律性。所有患者在術(shù)前自愿簽署支氣管鏡檢查知情同意書，均無下列麻醉禁忌證：①嚴重心律失常或心肌缺血；②不能控制的高血壓(EBUS-TBNA穿刺收縮壓>180 mmHg)；③凝血時間顯著異常，APTT延長1倍以上；④對麻醉藥物過敏；⑤重度呼吸困難；⑥嚴重的臟器功能不全；⑦孕婦；⑧近3月內(nèi)患有嚴重的出血性疾病及血栓性疾病[16-18]。

所有患者術(shù)前均進行胸部增強CT掃描檢查，提示患有肺門旁占位、肺門淋巴結(jié)腫大和/或縱膈占位、縱膈淋巴結(jié)腫大等病變。術(shù)前進行常規(guī)檢查，如血常規(guī)、凝血系列、心電圖，部分合并冠心病、高血壓患者進行心電圖和/或心臟彩超，合并COPD或肺心病患者行血氣分析和/或肺功能檢查，評估無明顯手術(shù)禁忌[8，12，19-20]。

二、麻醉方式

常規(guī)建立靜脈通路，適當進行補液，并行心電監(jiān)護(包括心率、血壓、血氧飽和度及呼吸等)及呼末CO2監(jiān)測。同時，給予面罩給氧，保持血氧飽和度SpO2在98%～100%。隨后給予注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉40 mg靜滴以抗炎及預(yù)防過敏，鹽酸托烷司瓊注射液5 mg靜推以預(yù)防嘔吐。采用全憑靜脈麻醉，給予丙泊酚注射液2～3 mg/kg，注射用鹽酸瑞芬太尼1～2 μg/kg進行麻醉誘導(dǎo)，待意識消失以后給予羅庫溴胺注射液0.6 mg/kg，等待肌松起效后置入喉罩(男性4號，女性3號)，術(shù)中采用高頻噴射通氣，呼吸18～20次/min，吸/呼比1︰2，噴射壓力0.35兆帕。麻醉維持靜脈持續(xù)滴注丙泊酚注射液4～5 mg/kg/h，注射用鹽酸瑞芬太尼0.1～0.2 μg/kg/min，注意術(shù)中調(diào)節(jié)丙泊酚注射液泵入量，使麻醉深度BIS值(bispectral index, BIS)維持在40～50之間。于穿刺結(jié)束前5 min停藥，患者自主呼吸恢復(fù)，意識轉(zhuǎn)清楚后再拔除喉罩。繼續(xù)觀察15～30 min，如患者無麻醉并發(fā)癥發(fā)生，即送回病房，接受后續(xù)處理[21-22]。

三、手術(shù)方法

經(jīng)喉罩插入超聲支氣管鏡，其手術(shù)操作要點：①將超聲支氣管在聲門裂上方12點方向插入氣管；②向水囊內(nèi)注入0.3～0.5 ml無菌生理鹽水；③根據(jù)影像學檢查擇點定位，將探頭貼緊支氣管壁掃描淋巴結(jié)，用多普勒超聲確認淋巴結(jié)與周圍血管的位置關(guān)系，然后探測淋巴結(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如回聲強弱、血管多寡及淋巴結(jié)大小等，切記動作輕柔；④確定合適的穿刺路徑，成功避開血管，選擇22G穿刺針，連同針芯一并插入內(nèi)鏡工作通道；⑤將穿刺針固定好，并按病灶大小確定進針深度，然后將穿刺針快速插入病灶內(nèi)部，在負壓注射器保持負壓5～15 ml下，反復(fù)在病灶中提抽20～30次。抽吸標本送呼吸科實驗室行分枝桿菌菌種鑒定(DNA微陣列芯片法)，并常規(guī)行細胞學及病理學檢查，部分標本進行免疫組化標記[23]。

四、病理診斷及抗酸染色

抽吸樣本立即送病理科，要求先離心后固定于甲醛溶液并石蠟包埋。然后進行HE染色，必要時進一步行免疫組化檢測以協(xié)助診斷并依據(jù)免疫組化結(jié)果進行相關(guān)腫瘤分型。抗酸染色采用Ziehl-Neelsen染色法。

五、抽吸標本結(jié)核桿菌DNA微陣列芯片法檢測

1. 組織DNA提取及純化： 采用DNeasy? Blood & Tissue Kit(QIAGEN，GERMANY)，按照其說明書進行EBUS-TBNA穿刺組織DNA提取及純化。得到的DNA樣本用于下一步檢測或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. PCR擴增： 選用博奧生物集團有限公司的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)進行PCR擴增。首先，選取10 μl的PCR擴增試劑。其次，將上一步提取好的DNA組織液2 μl加入相應(yīng)PCR管內(nèi)，立即混勻，然后瞬時離心。第三，確認PCR管蓋蓋緊，將其至于PCR擴增儀(ETC811，蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司)中進行PCR擴增反應(yīng)。注意，反應(yīng)熱循環(huán)程序必須嚴格按照試劑盒說明書進行設(shè)置。

3. 芯片雜交： 待擴增反應(yīng)結(jié)束后直接將擴增產(chǎn)物至于PCR儀中(95 ℃)，變性5 min后立刻將擴增產(chǎn)物進行冰浴(至少3 min)。然后將變性完成的產(chǎn)物按照試劑盒要求進行加樣。最后密封好雜交盒(50 ℃，雜交時間為2 h)。

4. 芯片洗滌與干燥： 經(jīng)2 h的雜交反應(yīng)后將芯片取出，立即將其放入芯片洗干儀(SlideWasherTM8，博奧生物集團有限公司)內(nèi)，給予洗滌液Ⅰ進行洗滌1次，頻率為120 s/次。其次，給予洗滌液Ⅱ洗滌2次，頻率為60 s/次。最后，取出芯片，將其放入離心甩干機內(nèi)進行離心干燥(30 s)，待甩干后予以掃描。

5. 芯片掃描及結(jié)果判讀： 使用博奧生物集團有限公司的微陣列芯片掃描儀(LuxScan 10K-B)和相應(yīng)軟件進行信號的讀取和結(jié)果的判讀。檢測樣本的相應(yīng)內(nèi)參及對照結(jié)果均正常，結(jié)果視為可靠，則進行下一步分析：將探針信號值和參考值相比較，如果探針信號值大于或等于該探針信號值的參考值，則判讀為陽性；反之，則判讀為陰性[20, 24-27]。

六、診斷標準

肺門、縱膈占位及淋巴結(jié)的惡性腫瘤診斷標準(符合以下條件之一即可確診)： ①手術(shù)切除標本證實為惡性腫瘤； ②EBUS-TBNA標本中查見腫瘤細胞；③標本查見可疑腫瘤細胞，且與其他檢查及臨床特征相符合者(如：PET-CT高度懷疑惡性腫瘤、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶、抗腫瘤治療后緩解等)[28-29]。

肺門、縱膈占位及淋巴結(jié)的結(jié)核診斷標準：(1)主要標準：①EBUS-TBNA或其他活檢方法取得組織，經(jīng)病理學檢查證實為結(jié)核肉芽腫性病變；②和/或微生物學檢查結(jié)果陽性；(2)次要標準：①臨床表現(xiàn)、實驗室檢測及影像學特征等相符合；②除外其他肉芽腫性疾?。虎劭菇Y(jié)核治療有效。確診標準：①符合主要標準任何一條者；②符合兩條以上次要標準者。

七、評價方法

惡性腫瘤以EBUS-TBNA穿刺組織病理學檢查結(jié)果作為評價標準，惡性為陽性；如無明確惡性證據(jù)者，但在后續(xù)隨訪出現(xiàn)疾病變化及病理檢查結(jié)果查見惡性證據(jù)者，也定性為陽性，并計算該方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及準確率。對于陰性患者然后依據(jù)病理結(jié)果不同，分別以查見結(jié)核性肉芽腫炎/肉芽腫壞死、查見類上皮細胞及壞死性炎，以及查見類上皮細胞及壞死性炎或者抽吸標本查熒光定量TB-PCR陽性等為依據(jù)，計算不同標準下縱隔淋巴結(jié)結(jié)核診斷準確率、敏感性及特異性。

結(jié) 果

所有患者均順利完成了EBUS-TBNA手術(shù)，除輕微咳嗽、少量痰中帶血、部分患者感覺輕微疼痛之外，無中重度手術(shù)并發(fā)癥，取得的標本合格。經(jīng)過3～6月隨訪，對所有研究對象進行最終診斷。4例失訪而無法得到最終良惡性結(jié)果，因此納入最終統(tǒng)計65例。

一、EBUS-TBNA對惡性腫瘤的診斷率

據(jù)EBUS-TBNA穿刺組織病理結(jié)果，惡性腫瘤27例，其中小細胞癌6例，腺癌8例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例，鱗癌3例，腎癌肺轉(zhuǎn)移1例，肺上溝瘤1例，未分類惡性腫瘤7例；非腫瘤38例。在這38例非腫瘤患者中，通過后期隨訪疾病變化情況及病理，有4例確診為惡性腫瘤。故最終所有研究對象中腫瘤患者共31例，非腫瘤患者34例。

經(jīng)統(tǒng)計得出，EBUS-TBNA診斷肺門、縱隔占位及淋巴結(jié)的惡性腫瘤敏感性為87.1% (27/31)。特異性為100%(34/34)、準確率為93.8%(61/65)，見表1。

二、EBUS-TBNA對縱隔淋巴結(jié)結(jié)核的診斷率

在34例非腫瘤病例中，通過細菌學檢查、治療并隨訪半年，最終確定：結(jié)核19例，塵肺1例，結(jié)節(jié)病7例，非結(jié)核分枝桿菌病2例，毛霉菌病1例，縱隔淋巴結(jié)囊腫1例，支氣管淀粉樣變性1例，淋巴結(jié)炎2例。

(1)若以EBUS-TBNA抽吸標本中病理查見結(jié)核性肉芽腫炎/肉芽腫壞死作為診斷結(jié)核的標準，其敏感性為68.7%(11/16)、特異性為78.9%(15/19)、準確率為74.3%(26/35)，見表2。

(2)若將病理結(jié)果解讀的范圍放寬，以“查見類上皮細胞、壞死性炎”作為診斷結(jié)核的標準，其敏感性為75%(15/20)、特異性為83.3%(15/18)、準確率為78.9%(30/38)，見表3。

(3)以TBNA病理結(jié)果以“查見類上皮細胞、壞死性炎”或者抽吸標本查熒光定量TB-PCR陽性為診斷結(jié)核的標準，其敏感性為90.5%(19/21)、特異性為100%(15/15)、準確率為94.4%(34/36)，見表4。

討 論

10年前縱隔病變的診斷需要借助外科縱隔鏡手術(shù)，創(chuàng)傷大、風險高，而EBUS-TBNA 針吸活檢術(shù)具有可視、可控、安全、準確的優(yōu)點，是一種超聲和呼吸介入相結(jié)合的微創(chuàng)技術(shù)，可用于縱隔病變的診斷以及肺癌的分期。我國在2008年引入該技術(shù)，目前在三甲醫(yī)院已經(jīng)廣泛開展，基本已取代了縱隔鏡。查閱國內(nèi)外多項研究論文發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)診斷準確率差異較大，其敏感性與操作者的經(jīng)驗水平密切相關(guān)。

表1 EBUS-TBNA對惡性腫瘤的診斷率

表2 EBUS-TBNA結(jié)核的診斷率(以病理查見結(jié)核性肉芽腫炎/肉芽腫壞死為診斷標準)

表3 EBUS-TBNA對結(jié)核的診斷率(以病理查見類上皮細胞、壞死性炎為診斷標準)

表4 EBUS-TBNA結(jié)核的診斷率(以病理查見類上皮細胞、壞死性炎或TB-PCR陽性為診斷標準)

EBUS-TBNA在肺癌分期中的應(yīng)用狀況如何？2009年有研究者回顧分析了11項關(guān)于EBUS-TBNA在肺癌分期當中的應(yīng)用[13, 19, 26]，共納入1 299例患者，統(tǒng)計分析出其診斷腫瘤的總敏感性約93%，特異性100%。本項研究結(jié)果顯示，EBUS-TBNA 診斷縱膈、肺門腫瘤的敏感性為87.1%，特異性為100%，準確率為93.8%，與既往研究結(jié)果基本相當。 但既往文獻顯示EBUS-TBNA在縱隔結(jié)核診斷的敏感性、特異性、準確率方面，各醫(yī)療機構(gòu)的數(shù)據(jù)存在較大差異：Hassan等[21]報告，其敏感性 95%，特異性 100%，陽性預(yù)測價值100%，陰性預(yù)測價值80%。而Navani等[23]發(fā)現(xiàn)其敏感性為94%，其中84%的患者標本的細胞形態(tài)學查見結(jié)核性肉芽腫性炎，47%的患者標本的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，但由于結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)周期較長，約為3～84 d，平均16 d，所以患者的住院時間和費用會隨之增加。Senturk等[24]也研究顯示，EBUS-TBNA 標本進行TB-PCR診斷胸腔內(nèi)結(jié)核的敏感性為56.7%，特異性為100%。Eom等[25]報告EBUS-TBNA標本進行DNA微陣列芯片法診斷胸腔內(nèi)結(jié)核的敏感性為56%，特異性為100%(小樣本研究)。王業(yè)等[26]報告通過EBUS-TBNA的組織標本形態(tài)學(查見結(jié)核性肉芽腫性炎)診斷結(jié)核的敏感性、特異性和準確率分別為65%、97.2%和89.9%。上述研究顯示，EBUS-TBNA在縱隔結(jié)核的敏感性和特異性上差異較大(56.7%～95%)，詳細閱讀文獻后發(fā)現(xiàn)差異的主要原因在于：①縱隔結(jié)核的病理金標準描述為“類上皮細胞、多核巨細胞灶狀增生、干酪樣壞死、肉芽腫形成”，但國內(nèi)病理機構(gòu)水平差別很大，或病理醫(yī)生的謹慎程度不一，比如我院病理中心在判斷“縱膈結(jié)核”時，病理報告極少出現(xiàn)“干酪性壞死、多核巨細胞、慢性肉芽腫”的典型結(jié)核肉芽腫描述，多數(shù)是以“纖維結(jié)締組織、多核巨細胞、壞死組織、慢性肉芽腫”來進行病理描述，因此容易造成結(jié)核的診斷難以確認；②結(jié)核病、非結(jié)核分枝桿菌病、結(jié)節(jié)病在病理上很難區(qū)分；③關(guān)于結(jié)核分枝桿菌的檢驗方法、試劑不統(tǒng)一，差異性較大。建議在以后的臨床工作中，加強臨床醫(yī)生和病理科醫(yī)生的溝通，在結(jié)核病的診治指南上病理金標準還需細化。

關(guān)于結(jié)核的各種輔助診斷方法有很多，常用的有AFB檢測、結(jié)核抗體檢測、結(jié)核特異性的 IFN-γ Elispot檢測等，他們對于縱隔結(jié)核的診斷率都很低且缺乏特異性[30]。而EBUS-TBNA標本檢測熒光定量TB-PCR(DNA微陣列芯片法)和FISH法測定結(jié)核分枝桿菌是新型快速生物檢測方法，而且其在縱隔結(jié)核中應(yīng)用的資料鮮有報道。

本文結(jié)果中19例結(jié)核患者中，僅有9例TBNA標本以DNA微陣列芯片法檢出分枝桿菌，其中結(jié)核分枝桿菌6例、非結(jié)核分枝桿菌3例，說明穿刺標本中查見分枝桿菌的陽性率低于50%；但如果以EBUS-TBNA標本檢測熒光定量TB-PCR聯(lián)合病理檢查，則可以將縱隔結(jié)核診斷敏感性提高到90.4%、特異性高達100%，說明兩種方法聯(lián)合使用可以大大提高診斷率，并縮短檢驗周期至3～5 d，而且該方法簡單易行，并不增加手術(shù)時間和手術(shù)風險，所以值得臨床推廣應(yīng)用。當然，我們研究樣本量小，其代表性、可靠性還不夠，后續(xù)仍需要擴大樣本量深入研究。