NLRP3炎癥小體在ICU獲得性衰弱大鼠呼吸肌和下肢肌中的表達(dá)

向朝雪 李福祥， 朱忠立 劉 暢 胡 健 黎俊雅 祝國蕓 宋羽希

重癥監(jiān)護(hù)室獲得性衰弱(intensive care unit-acquired weakness, ICU-AW)是嚴(yán)重疾病的常見并發(fā)癥，在重癥監(jiān)護(hù)病房的患者中發(fā)生率約為50%[1]。呼吸肌無力往往影響撤機(jī)，導(dǎo)致拔管延遲，從而延長機(jī)械通氣時間，增加住院時間。四肢肌肉功能障礙將導(dǎo)致生活質(zhì)量下降和病死率增加[2]。由于肌肉萎縮的恢復(fù)非常緩慢，ICU-AW會導(dǎo)致身體機(jī)能的長期損害[3-4]；甚至有報道稱ICU-AW患者出院6個月后身體功能仍然受損[5]。

多項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥是ICU-AW發(fā)生的重要的獨立危險因素[6-8]。全身性炎癥反應(yīng)綜合征和/或重要臟器炎癥損害過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子造成肌肉組織損傷；而蛋白質(zhì)合成和分解之間不平衡最終造成吸肌和下肢肌丟失和ICU-AW的發(fā)生[9]。本文在前期的研究中成功構(gòu)建ICU-AW大鼠模型，在此基礎(chǔ)上探討炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)及其下游分子在膿毒癥相關(guān)呼吸肌和下肢肌中的作用和機(jī)制，旨在為ICU-AW的診治提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料與試劑

兔抗NLRP3、Fbx32、GAPDH購于美國Abcam公司，兔抗IL-18、IL-1β、caspase1-p20、MURF1購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣Marker、Loading buffer購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，PCR引物、SYBRGreen Ⅰ購于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit購于寶生物工程(大連)有限公司；HE染色試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其它未列出試劑純度均達(dá)到分析純。

二、實驗動物及分組

5～7周齡清潔級健康雄性SD大鼠40只，體重200～240 g，購于成都達(dá)碩生物科技有限公司(生產(chǎn)許可證號：scxk(川)2008-24)。采用完全隨機(jī)的方法將SD大鼠分為兩組：對照組(sham組)、實驗組(膿毒血癥組)。實驗用大鼠于我院實驗中心動物房飼養(yǎng)，實驗中所有損傷和程序均經(jīng)過西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

三、動物模型制備

采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)的方法對大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后將其仰臥固定于操作臺。實驗組(膿毒血癥組)大鼠在無菌條件下切開腹膜、暴露盲腸，擠出盲腸內(nèi)空氣后，在距離盲腸末端1 cm處使用醫(yī)用真絲編織線結(jié)扎，采用12號針頭在結(jié)扎的盲腸中部單次刺孔。而后，將盲腸回置于腹腔，逐層縫合腹膜、肌肉和皮膚。術(shù)后于大鼠背部皮下組織注射生理鹽水5 ml行液體復(fù)蘇。手術(shù)過程中未使用抗生素。對照組(sham組)大鼠切開腹膜、暴露盲腸，不行盲腸結(jié)扎、穿孔。所有大鼠均在同樣的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、水。術(shù)后96 h，分離所有大鼠雙側(cè)膈肌和腓腸肌，左側(cè)膈肌和腓腸肌用4%中性甲醛溶液固定后行病理學(xué)檢查；右側(cè)膈肌和腓腸肌于液氮中凍存，用于其它實驗。

四、檢測方法

1. 肌肉組織病理檢測： 取對照組和實驗組大鼠左側(cè)膈肌和腓腸肌迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋，以厚度4 μm切片，而后按照蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒操作說明書的步驟進(jìn)行HE染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。采用IPP6.0圖像分析軟件測定肌纖維橫截面積，每張切片測5個視野，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2. qRT-PCR檢測： 采用qRT-PCR方法檢測右側(cè)腓腸肌、膈肌中NLRP3、Atrogin-1、MuRF1、Caspase-1、IL-1β和IL-18基因的表達(dá)(引物序列見表1)。提取右側(cè)腓腸肌、膈肌組織標(biāo)本中的RNA，采用Nanodrop 2000分光光度計測定RNA的濃度和OD 260/280比值。各樣本均按照5 μg RNA相對應(yīng)的體積，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在10 μl的反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，條件為42 ℃，60 min；95 ℃，5 min。而后，按照qRT-PCR說明書要求，利用全自動熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR；反應(yīng)條件為：95 ℃，2 min，95 ℃，15 s，60 ℃，30 min(40個循環(huán))；60 ℃，5 s。以GAPDH作為內(nèi)參，各目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔct法進(jìn)行計算。

3. Western blot方法檢測： 采用western blot的方法檢測各組大鼠腓腸肌和膈肌組織中Atrogin-1、MuRF1、NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的表達(dá)。分別取50 mg腓腸肌、膈肌組織標(biāo)本，用T-PER組織裂解液(Thermo, 美國)進(jìn)行裂解；采用BCA法測定樣品蛋白濃度。將100 μg蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液充分混合后，在100 ℃條件下變性10 min。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳，而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于室溫條件下用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h；在4 ℃條件下孵育一抗過夜(Atrogin-1、MuRF1、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β抗體稀釋比1︰1 000)；采用TBST溶液洗膜后，用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1︰5 000)在室溫條件下孵育2 h，洗膜后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)收集信號；最后，以GAPDH為內(nèi)參對目的基因條帶灰度進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 目的基因qRT-PCR引物序列

五、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、膿毒血癥時大鼠吸肌和下肢肌形態(tài)的變化

為了明確膿毒血癥對ICU-AW時肌肉萎縮的影響，本研究首先探索了盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后膿毒血癥對大鼠腓腸肌和膈肌形態(tài)的影響。沿腓腸肌纖維縱行切片的結(jié)果(圖1A和D)表明，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后96 h，大鼠腓腸肌中細(xì)胞核的數(shù)量減少，肌纖維排列較對照組更為疏松；而沿腓腸肌纖維的橫截面的染色結(jié)果(圖1B和E)更為清晰地展現(xiàn)了上述變化。此外，對膈肌標(biāo)本的HE染色也觀察到了類似的變化(圖1C和F)。

二、膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌纖維橫截面積對比

明確膿毒血癥ICU-AW大鼠腓腸肌和膈肌的病理變化后，我們分析了兩組大鼠腓腸肌和膈肌橫截面積的差異。對照組大鼠腓腸肌橫截面積為(878.74±201.94)μm2，實驗組大鼠腓腸肌纖維橫截面積為(345.90±127.02)μm2，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。對膈肌纖維橫截面積的分析結(jié)果表明，對照組大鼠膈肌纖維橫截面積為(573.01±210.46)μm2，而實驗組大鼠膈肌纖維的橫截面積為(140.40±67.79)μm2，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)。這一結(jié)果表明盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)96 h后，大鼠吸肌和下肢肌纖維的橫截面積明顯減小，見表2。

圖1 盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后96 h大鼠腓腸肌和膈肌HE染色結(jié)果；注：A：對照組 沿腓腸肌纖維縱軸切片；B：對照組 沿腓腸肌纖維縱軸的橫截面切片；C：對照組 沿膈肌纖維縱軸切片；D：實驗組 腓腸肌纖維縱軸切片；E：實驗組 沿腓腸肌纖維縱軸的橫截面切片；F：實驗組：沿膈肌纖維縱軸切片

表2 對照組和實驗組大鼠腓腸肌和膈肌纖維橫截面積對比

三、膿毒血癥對大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1基因表達(dá)的影響

在明確膿毒血癥導(dǎo)致大鼠腓腸肌和膈肌纖維萎縮的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索了盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)96 h后大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1基因的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果表明，對照組大鼠腓腸肌中MuRF-1和Atrogin-1的基因表達(dá)量分別為0.78±0.12和0.88±0.09；而實驗組大鼠腓腸肌組織中MuRF-1和Atrogin-1基因表達(dá)量為3.24±0.20和24.19±3.81；與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相似地，在實驗組大鼠膈肌組織中也觀察到Atrogin-1和MuRF-1基因表達(dá)量較對照組明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 對照組和實驗組大鼠腓腸肌和膈肌中Atrogin-1和MuRF-1基因表達(dá)

四、膿毒血癥對大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白的表達(dá)變化

本文進(jìn)一步明確了盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)96 h后大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果如圖2A所示，實驗組大鼠腓腸肌中Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)量較對照組明顯升高(P<0.05)；類似地，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)96 h后大鼠膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白表達(dá)量較對照組亦明顯升高(圖2B)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。并且，在膈肌中Atrogin-1和MuRF-1蛋白表達(dá)量增加的幅度比腓腸肌更為明顯。

圖2 膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白的表達(dá)

五、膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達(dá)

本文檢測了ICU-AW大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達(dá)變化，結(jié)果顯示，對照組大鼠腓腸肌中NLRP3 mRNA表達(dá)量為0.91±0.16，而其在實驗組大鼠腓腸肌組織的相對表達(dá)量為3.16±0.18，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0007)。對NLRP3下游分子的mRNA表達(dá)量的檢測結(jié)果表明，對照組大鼠腓腸肌中Caspase-1、IL-18及IL-1β的相對表達(dá)量分別為1.25±0.78、0.72±0.15、0.0003±0.0001；而在實驗組大鼠腓腸肌組織的表達(dá)量為18.01±0.45、1.54±0.03、0.0025±0.0006；差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相似地，對膿毒血癥對大鼠膈肌組織的研究結(jié)果也表明，實驗組大鼠膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，見表4。

表4 膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達(dá)

圖3 膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子蛋白表達(dá)

六、膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子蛋白表達(dá)變化

在上述結(jié)果基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步驗證了ICU-AW大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子蛋白表達(dá)變化。如圖3A所示，膿毒血癥96 h后，大鼠腓腸肌組織中NLRP3及其下游分子Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高(P<0.05)。相似地，對膿毒血癥大鼠膈肌組織的檢測結(jié)果也表明，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)96 h后大鼠膈肌組織中NLRP3及其下游分子Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高(P<0.05)，見圖3B。

討 論

ICU-AW是一種床旁診斷，指ICU的患者在沒有確切原因的情況下發(fā)生的明顯虛弱[3]，威廉·奧斯勒(William Osler)于1892年首先描述了嚴(yán)重膿毒癥引起的“肉體快速流失”[10]，2009年被確認(rèn)并更名為“重癥監(jiān)護(hù)室獲得性衰弱(ICU-AW)”[3]。已有的研究結(jié)果表明膿毒癥、機(jī)械通氣、長時間制動、高血糖狀態(tài)、長時間激素及神經(jīng)肌肉阻滯藥物治療等均與ICU-AW的發(fā)生有關(guān)[11]。

ICU-AW發(fā)病機(jī)制有多種理論，ICU-AW發(fā)病機(jī)制研究的動物模型制備方法也有多種，包括去神經(jīng)支配-類固醇模型、廢用性模型、膿毒血癥模型、ICU模型、重癥患者體外血清激發(fā)試驗?zāi)Ｐ?、兔燒傷模型、高血糖模型等[12]。本課題組在前期的研究中成功構(gòu)建了膿毒血癥大鼠ICU-AW模型[13]。在此基礎(chǔ)上，本文探討了ICU-AW時大鼠吸肌和下肢肌溶解的情況。HE染色和分析的結(jié)果表明，膿毒血癥時大鼠腓腸肌和膈肌中肌纖維排列更為疏松，肌纖維的橫截面積較對照組明顯減小，說明吸肌和下肢肌發(fā)生了一定程度的溶解。已有的報道表明，肌肉溶解的機(jī)制非常復(fù)雜，危重病患者入ICU后不久吸肌和下肢肌中就會出現(xiàn)肌球蛋白重鏈(MyHC)的持續(xù)喪失[14]。MyHC和許多其他肌原纖維蛋白(如肌球蛋白結(jié)合蛋白)參與MuRF1的合成[15]，肌球蛋白D(MyoD)參與Atrogin-1的合成[16]。本課題檢測并明確膿毒血癥時大鼠腓腸肌和膈肌組織中MuRF1和Atrogin-1的表達(dá)較對照組明顯升高，從分子層面證明ICU-AW時大鼠吸肌和下肢肌可發(fā)生一定程度的溶解。

炎癥小體由感受蛋白(包括多種炎癥小體相關(guān)蛋白)、連接蛋白(凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白)以及效應(yīng)蛋白組成[17]。其中，NLRP3炎癥小體是研究較為深入的炎癥小體，由結(jié)合蛋白NLRP3、連接蛋白ASC、效應(yīng)蛋白caspase-1組成。目前已明確多種內(nèi)/外源性刺激可激活NLRP3炎癥小體，活化后的NLRP3炎癥小體通過NBD結(jié)構(gòu)域形成多聚體，募集caspase-1并水解其非活性片段[18]。活化后的caspase-1可切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子，還能誘導(dǎo)細(xì)胞的炎癥壞死和組織細(xì)胞焦亡[19]。本課題的研究結(jié)果表明，盲腸結(jié)扎穿孔96 h后，大鼠腓腸肌和膈肌組織中NLRP3基因和蛋白表達(dá)的水平均明顯高于對照組；此結(jié)果與繼往NLRP3參與炎癥反應(yīng)的結(jié)果相似[20]。在此基礎(chǔ)上，我們探索了NLRP3炎癥小體相關(guān)分子在ICU-AW大鼠模型腓腸肌和膈肌組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后96 h，大鼠腓腸肌和膈肌中Caspase-1、IL-18、IL-1β基因和蛋白表達(dá)量均明顯高于對照組，進(jìn)一步說明NLRP3炎癥小體參與了ICU-AW。

綜上所述，盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備的膿毒血癥模型中，吸肌和下肢肌溶解參與ICU-AW的發(fā)生；同時，本文研究結(jié)果也說明NLRP3炎癥小體參與上述過程。本文仍有不足之處，目前的研究僅限于對NLRP3炎癥小體在膿毒血癥ICU-AW大鼠模型中表達(dá)及其與吸肌和下肢肌萎縮關(guān)系的研究，尚未深入探討NLRP3炎癥小體參與ICU-AW的病理生理學(xué)機(jī)制，這是在后續(xù)研究中尚需要補(bǔ)充和完善的內(nèi)容。