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    循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測用于卵巢癌診治的臨床價值*

    2020-04-29 06:56:02璨,王
    中國藥業(yè) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:卵巢癌上皮標(biāo)志物

    楊 璨,王 輝

    (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400016)

    卵巢癌作為女性生殖道腫瘤病死率最高的惡性腫瘤[1],臨床早期診斷困難,發(fā)現(xiàn)時多為晚期,預(yù)后差,治療方案以切除既有癌組織輔以鉑類、紫杉醇為基礎(chǔ)的化學(xué)治療(化療)為主,以此延長患者的總生存期(OS)及無進(jìn)展生存期(PFS)[2]?,F(xiàn)今多樣化的治療方案輔以抗腫瘤血管生成藥物(如貝伐單抗)、聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)抑制劑(如奧拉帕尼)[3 -4]等的臨床使用,雖不同程度延長了患者的PFS,但術(shù)后殘留的病灶或肉眼無法識別的微小病灶依舊是影響預(yù)后的重要因素[5]。目前的手段主要是通過腫瘤標(biāo)志物或影像學(xué)的檢測對卵巢癌患者進(jìn)行隨訪,而對某些腫瘤標(biāo)志物陰性的患者,僅可通過影像學(xué)的評估變化其狀態(tài),缺乏早期診斷、療效評估及預(yù)后評估的有效手段。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測因具有采用血樣標(biāo)本的可操作性、可重復(fù)性及前瞻性的優(yōu)勢,成為卵巢癌臨床監(jiān)測必備手段。

    1 CTCs

    1.1 定義

    CTCs 是由自發(fā)或診療操作,源于實(shí)體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶,且只有少數(shù)具有高活性的CTCs 可逃離機(jī)體的免疫損傷而存活,并通過血液運(yùn)行轉(zhuǎn)移到其他組織器官中形成轉(zhuǎn)移灶的稀有細(xì)胞[6]。自1869 年首次報道在1 例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液中觀察到CTCs 開始[7],再到1889 年的“種子土壤學(xué)說”—— 腫瘤微環(huán)境提供腫瘤增殖及侵襲的相關(guān)分子,如細(xì)胞因子、生長因子等可促進(jìn)細(xì)胞遷移,經(jīng)過數(shù)百年時間,CTCs 的臨床價值和研究潛力正被逐漸顯現(xiàn)。近20 年P(guān)ubMed 上相關(guān)發(fā)文情況見圖1。

    圖1 PubMed 近20 年發(fā)表關(guān)于CTCs 的文章量

    1.2 轉(zhuǎn)移

    腫瘤患者生存期短的原因主要是腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,但轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。最近有研究表明,腫瘤轉(zhuǎn)移存在以下2 種模式。

    1)傳統(tǒng)的模型是單個腫瘤細(xì)胞依賴上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),即原發(fā)腫瘤的上皮細(xì)胞獲得脫離原發(fā)灶浸潤周圍組織進(jìn)入血液的能力,進(jìn)入血液形成CTCs,逃逸機(jī)體免疫,適應(yīng)新的腫瘤微環(huán)境,在患者其他組織器官間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)形成新的轉(zhuǎn)移灶[8]。原發(fā)腫瘤以EMT 形式進(jìn)行轉(zhuǎn)移,CTCs 在血液中以上皮型、混合型、間質(zhì)型3 種形式存在。且相關(guān)研究表明,若在血液中發(fā)現(xiàn)較多混合型或間質(zhì)性CTCs,表明患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的風(fēng)險增大[9]。

    2)原發(fā)腫瘤以鏈、團(tuán)或聚集成循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇的形式浸入周圍組織,并向受損血管內(nèi)灌注,CTCs 簇吸引血細(xì)胞形成微血栓,與單個CTCs 相比存活率更高、外滲速度更快、侵襲性更強(qiáng)[10]。LEE 等[11]在一項(xiàng)納入24 例原發(fā)性卵巢癌和30 例復(fù)發(fā)患者的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn),在復(fù)發(fā)患者和耐藥患者血液中能找到更多的CTCs 簇,提示其與總體生存率呈負(fù)相關(guān)。無論腫瘤細(xì)胞通過何種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移,患者血液中的CTCs 被視為最主要的潛在轉(zhuǎn)移因素之一,監(jiān)測不同類型的CTCs 更利于準(zhǔn)確判斷預(yù)后、有效診斷及制訂更實(shí)用的治療方案。

    1.3 檢測

    1 mL 血液中含有數(shù)十億個細(xì)胞,而CTCs 非常罕見,僅占白細(xì)胞總數(shù)的1/(106~107),如何克服其數(shù)量少帶來的技術(shù)限制是目前集中研究的問題。CTCs 的檢測一般通過富集和鑒定2 個步驟進(jìn)行檢測。

    富集:由于CTCs 的稀缺性,必須在被發(fā)現(xiàn)前進(jìn)行富集,目前所有技術(shù)主要依賴細(xì)胞的生物學(xué)特性及其固有物理特性。

    1)依賴細(xì)胞生物學(xué)特性的富集技術(shù),利用特定標(biāo)志物,這些標(biāo)志物由腫瘤細(xì)胞表達(dá)但血細(xì)胞不表達(dá)[如上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)]及由血細(xì)胞表達(dá)但CTCs 不表達(dá)(如CD45),再以磁珠與相應(yīng)抗體結(jié)合,利用其復(fù)合物的磁性進(jìn)行富集[12]。目前臨床最常用的是被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的依賴EpCAM 抗體的Cellsearch 檢測系統(tǒng),利用免疫磁珠對7.5 mL 外周血中的CTCs 進(jìn)行富集[13-14],多用于評估晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等的預(yù)后,但VAN BERCKELAER 等[15]指出,在卵巢上皮癌中依賴EpCAM 的富集方式得到的結(jié)果欠佳,其原因可能為卵巢上皮癌中EpCAM 陽性的CTCs 較少及EpCAM 在EMT 過程中減少。故在此基礎(chǔ)上,為了彌補(bǔ)Cellsearch 只能識別表達(dá)EpCAM 腫瘤的缺陷,新技術(shù)利用的抗體不僅能識別上皮腫瘤標(biāo)志物EpCAM 和細(xì)胞角蛋白(CK)7/8/18/19、白細(xì)胞標(biāo)志物CD45,還能篩選間質(zhì)腫瘤標(biāo)記物波形蛋白(Vimentin)和Twist 蛋 白[16],從 而 有 效 富 集 各 類CTCs。

    2)依賴細(xì)胞固有物理特性的富集技術(shù),可幫助CTCs 與血液中的正常細(xì)胞(如白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血干細(xì)胞)區(qū)分開而無須生物標(biāo)記。在這些物理特性主要集中在CTCs 和血細(xì)胞特性的差異上,主要是細(xì)胞大小、細(xì)胞可變性及電學(xué)性上,如利用上皮腫瘤細(xì)胞比外周血細(xì)胞大的膜過濾法(ISET),能迅速在不破壞細(xì)胞形態(tài)的前提下分離CTCs[16];還有利用細(xì)胞密度梯度進(jìn)行分離的方法,但試驗(yàn)溫度及操作時間控制不當(dāng)會使細(xì)胞受到破壞而降低其純度。

    鑒定:CTCs 被富集后需再次鑒定,依賴其本身抗原及腫瘤遺傳特異性,主要采用免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)2 種檢測方法[17]。ICC 是利用熒光抗體與腫瘤標(biāo)記物特異性結(jié)合的技術(shù),具有較高敏感性,再聯(lián)合流式分析技術(shù),即利用ICC 標(biāo)記的熒光信號,對CTCs 實(shí)現(xiàn)快速高效分選及定量分析;RTPCR 主要是發(fā)現(xiàn)血液中腫瘤表達(dá)的相關(guān)mRNA,然后將mRNA 鏈逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過PCR 擴(kuò)增多個相關(guān)腫瘤標(biāo)志物,分析其表達(dá)模式[18]。

    2 卵巢癌的臨床診斷

    卵巢癌由于發(fā)現(xiàn)晚、診斷困難影響了患者的有效治療時機(jī),故目前臨床急需發(fā)現(xiàn)早期診斷卵巢癌的有效方法。

    ZHANG 等[19]采用免疫磁珠法對109 例卵巢癌患者測定CTCs,并對其中51 例患者同時檢測CTCs 及糖蛋白125(CA125),發(fā)現(xiàn)90.00%的初診患者檢測出CTCs,且CTCs 的數(shù)量與分期相關(guān)(P=0.034),ⅠA ~ⅠB 期患者CTCs 的陽性率為92.16% ,遠(yuǎn)高于同一患者CA125 的陽性率(64.47%),提示CTCs 檢測較CA125可早期診斷卵巢癌。

    PEARL 等[20]利用功能性富集法收集術(shù)前疑似卵巢上皮癌的129 例患者CTCs,將其中58 例良性、Ⅰ、Ⅱ期疾病患者進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)CTCs 檢測在Ⅰ、Ⅱ期敏感性為40.85% ,特 異 性 為95.10% ,陽 性 預(yù) 測 值(PPV)為77.80%,然而CA125 特異性僅為76.20%,再次提示CTCs 可作為卵巢癌早期診斷指標(biāo)之一。

    SUH 等[21]前瞻性收集術(shù)前未明確附件包塊性質(zhì)的87 例患者血清腫瘤標(biāo)志物CA125、ROMA 值、CT 或MRI 及CTCs,發(fā)現(xiàn)在早期癌癥中CTCs 檢測較其他檢測方式敏感性更高,提示CTCs 對術(shù)前附件包塊的良惡性鑒別具有重要意義。

    RIED 等[22]以ISET 法收集癌癥患者及有高危因素的但無癥狀患者的CTCs,發(fā)現(xiàn)所有癌癥患者和半數(shù)篩查無癥狀患者均檢測到CTCs,在CTCs 呈陽性的10 個月內(nèi),20%的篩查患者中發(fā)現(xiàn)了早期癌癥病變,提示利用CTCs 進(jìn)行篩查可升高附件惡性腫瘤早期發(fā)現(xiàn)率。

    3 卵巢癌的療效評估及指導(dǎo)個體化用藥

    丁凌雁等[23]利用流式細(xì)胞儀收集60 例晚期卵巢癌(Ⅲ~Ⅳ期)患者化療2 周期前后CTCs,研究結(jié)果顯示,化療后患者CTCs 減少,且提示CTCs 減少的患者較外周血CTCs 計數(shù)≥5 的患者平均PFS 延長約6 個月(13.2 個月比6.4 個月),提示CTCs 與患者化療療效及預(yù)后有關(guān)。

    目前,卵巢癌一線化療方案以鉑類為主,鉑類藥物主要作用于腫瘤細(xì)胞DNA,引起腫瘤細(xì)胞DNA 復(fù)制障礙,從而抑制其分裂,機(jī)體由此開始反應(yīng),細(xì)胞內(nèi)核酸切除修復(fù)系統(tǒng)開始修復(fù)鉑類藥物對細(xì)胞造成的損傷,其中最主要的基因?yàn)榍谐迯?fù)交叉互補(bǔ)組1(ERCC1)基因[24]。

    CHEBOUTI 等[25]采用單鏈RT-PCR 對ERCC1 進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)以鉑類為基礎(chǔ)化療的卵巢癌可能導(dǎo)致ERCC1 基因陽性的CTCs 增加,修復(fù)鉑類藥物對癌癥細(xì)胞造成的損害,從而削弱鉑類化療療效,提示ERCC1 基因可作為診斷卵巢癌耐藥基因之一。

    OBERMAYR 等[26]還在對比卵巢癌患者外周血樣本時發(fā)現(xiàn),化療后鉑耐藥的患者比鉑敏感的患者更能檢測到親環(huán)素C(PPIC)陽性的CTCs,提示PPIC 可能與卵巢癌患者鉑耐藥有關(guān)。

    CHEBOUTI 等[27]檢測91 例卵巢癌患者術(shù)前及化療后CTCs,發(fā)現(xiàn)以鉑類為基礎(chǔ)化療的卵巢癌患者出現(xiàn)EMT-CTC 聚集,并引起CTCs 的分子表型向間質(zhì)表型(如Twist,PI3Kα,Akt-2)轉(zhuǎn)化,提示腫瘤可能向鉑耐藥方向發(fā)展。

    CTCs 不僅能作為評估卵巢癌患者化療的參考指標(biāo),還提供對化療可能產(chǎn)生反應(yīng)的相應(yīng)特殊基因,為及時更換化療方案提供可監(jiān)測的手段。

    4 卵巢癌預(yù)后

    POVEDA 等[28]通過Cellsearch 系統(tǒng)納入216 例復(fù)發(fā)的晚期卵巢癌患者CTCs,并囊括CA125、鉑敏感性、腫瘤最大直徑等多因素分析,發(fā)現(xiàn)CTCs 多患者較CTCs陰性患者的病情進(jìn)展及死亡風(fēng)險高(分別為1.58 及1.54 倍),提示CTCs 數(shù)量與預(yù)后呈反相關(guān)。

    董小麗等[29]收集31 例術(shù)后將行周期化療的卵巢上皮癌患者,在術(shù)后化療開始前、3 次化療后1 周內(nèi)、6 次化療后1 周內(nèi)收集CTCs,發(fā)現(xiàn)隨著化療的逐步進(jìn)行,CTCs 整體呈下降趨勢,12 例完成6 個月隨訪的患者中4 例復(fù)發(fā),CTCs 陽性且以間質(zhì)型和混合型CTCs 為主,表明化療后仍能檢測出CTCs 的卵巢癌患者,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概率越高,預(yù)后越差。

    ZHOU 等[30]在Meta 分析中匯集11 篇文獻(xiàn),囊括1 129 例卵巢癌患者,指出與CTCs 陰性組相比,CTCs陽性組患者的OS、PFS 及無病生存期(DFS)更短,且指出CTCs 的存在與血清腫瘤標(biāo)志物CA125 的增加有關(guān),再次提示CTCs 可作為監(jiān)測卵巢癌預(yù)后的指標(biāo)之一。

    5 結(jié)語

    CTCs 的優(yōu)勢主要基于其獨(dú)特的潛力提供了“液體活檢”樣本,易得到疾病在多個時間點(diǎn)的樣本信息,可用于評估早期療效,幫助建立個性化的治療方法,提高療效減少成本。CTCs 在DNA 和RNA 及所表達(dá)的特征蛋白質(zhì)水平均可作為“液體活檢”方法。有研究分析ctDNA與腫瘤活檢中發(fā)現(xiàn)的突變和表觀遺傳變化具有一致性,且可能較CTCs 對治療期間的微小殘留灶有更高的敏感性[31-32]。在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)官方網(wǎng) 站(https:/ /clinicaltrials.gov/ct2/home)分 別 以“Circulating Tumor Cells”“Circulating Tumor DNA”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索(2020 年1 月15 日),顯示有860 篇及405 篇臨床研究正在進(jìn)行。在尋找各個類型癌癥時,發(fā)現(xiàn)了系列評估CTCs 和ctDNA 作為“液體活檢”作用的臨床研究(見圖2),雖然這些研究采取不同方式、不同人群、不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,但仍可能成為推進(jìn)“液體活檢”作為新一代腫瘤標(biāo)志物檢查的證據(jù)。

    圖2 NIH 官方網(wǎng)站基于CTCs 和ctDNA 所獲得的各類腫瘤臨床研究

    目前,CTCs 的臨床意義已在多種類型實(shí)體腫瘤中得到有效評價,盡管其檢測正逐步應(yīng)用于臨床,但還存在以下不足:1)目前找尋外周血CTCs 的方式有限,尚無統(tǒng)一檢測標(biāo)準(zhǔn);2)檢查費(fèi)用高昂,經(jīng)濟(jì)實(shí)用性欠佳;3)多數(shù)研究無法證明CTCs 在外周血釋放規(guī)律,且無大數(shù)據(jù)隨訪患者相關(guān)生存期及療效。上述原因可能會影響CTCs 檢測在臨床的廣泛應(yīng)用。但通過CTCs 檢測的不斷探索、更新及大樣本數(shù)據(jù)臨床試驗(yàn)的逐步開展,若能統(tǒng)一CTCs 相關(guān)抗原標(biāo)記物,增加其敏感性及特異性,逐步降低檢測費(fèi)用,CTCs 檢測在卵巢惡性腫瘤中的臨床使用前景及實(shí)用價值將得到進(jìn)一步提升。

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